تعد البروتياسات واحدة من أكثر المجموعات التي تم التحقيق فيها من الدعامات الجزيئية الحيوية في الأبحاث الأكاديمية والصناعية. دورها القوي في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية يجعلها هدفا بارزا في مجال اكتشاف المخدرات أيضا. وفيما يتعلق ببحوثهم المكثفة، هناك طلب كبير ومستمر على تطوير منصات فحص الفلوريس بروتياز المتوافقة مع الفلوراسنس المتوافقة مع الفلوراسس لتوفير الوقت والتكلفة.
هنا ، نود أن نقدم بروتوكولًا لتطبيق منصة فحص الفلوريسانس المتوافقة مع الفراق باستخدام ركائز protease الانصهار المؤتلفة . بالإضافة إلى ذلك، نود أن تظهر طريقة لرناتونات في هلام من ركائز وشظايا الانقسام من عينات مقايسة بعد denaturing SDS-PAGE كذلك. وتجري جميع التجارب على مثال فيروس نقص المناعة البشرية-1 البروتياس.
التعبير plasmid يحمل تسلسل الترميز من الوسم تقارب الهستاة والهستة وبروتين الانصهار ملزمة مالتوس تليها موقع السيطرة على شق من التبغ البروتيز فيروس النقش، كاسيت الاستنساخ، و بروتين الفلورسنت C الطرفية. خطية التعبير plasmid بواسطة PacI وNheI قيود endonucses. أداء الصلب من Escherichia القولونية codon الأمثل إلى الأمام وعكس oligonucleotide التمهيديات التي رمز لسلسلة الركيزة من الفائدة والجناح من قبل PacI وNheI نهايات متماسكة.
تنفيذ الإدراج التمهيدية المتينة في التعبير الخطي plasmid بواسطة الربط. للحصول على تعبير البروتين، تحويل BL21 (DE3) الخلايا المختصة من قبل خليط الربط. البروتينات الفلورسنت ستكون في نفس إطار القراءة المفتوحة مع علامات الانصهار N-Terminal فقط بعد الربط الناجح.
بعد أيام قليلة من التحول ، والمستعمرات التي تحتوي على التعبير plasmid ترميز موقع الانقسام إدراج الفائدة سوف تظهر الفلورانس مرئية مع أو حتى من دون استخدام Transilluminator الأزرق قارئ الظلام. إضافة 10 ميكروليترس الجلسرين مخزون من BL21 (DE3) الخلايا التي تحمل التعبير plasmid الترميز لتسلسل موقع الانقسام من الفائدة إلى خمسة ملليلتر LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. احتضان التعليق في 37 درجة لمدة 15 ساعة في حين تهتز باستمرار.
نقل خمسة ملليلتر الثقافة البكتيرية إلى 50 ملليلتر جديدة LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين. تنمو الخلايا في 37 درجة إلى امتصاص من 0.6 إلى 0.8 في 600 نانومتر أطوال موجية. عند هذه النقطة، والحث على التعبير البروتين بإضافة IPTG.
بعد ذلك، احتضان الثقافة لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة في حين تهتز باستمرار. بعد الحضانة، ونقل 25 ملليلتر من الثقافة إلى أنابيب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر نظيفة، وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المناط وتخزين كريات الخلايا البكتيرية عند ناقص 70 درجة لمدة ساعة على الأقل.
الكريات الخلية التي تحتوي على البروتينات الفلورية التي أعرب عنها بنجاح تظهر بوضوح الفلوريسنس مع أو حتى من دون استخدام ترانيلوميناتور الأزرق قارئ الظلام. وضع بيليه الخلية المجمدة على الجليد والسماح لها ذوبان لمدة 15 دقيقة. إضافة اثنين ملليلتر تحلل العازلة إلى بيليه وتعليق الخلايا.
بعد ذلك ، أضف مثبط البروتياز ، حر التعليق من قبل lyzozyme و DNase ، واوقف الخلايا ، واحتضان التعليق على الجليد لمدة 15 دقيقة. نقل مرتين تعليق ملليلتر واحد في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر و sonicate التعليق لمدة ثلاث دقائق في جولات من 10 ثانية من سونيكيشن وخمس ثوان فاصل. الطرد المركزي الأنابيب في 10، 000 غرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
مسح الخلايا البكتيرية lysates التي تحتوي على الركيزة الفلورسنت من الفائدة تظهر الفلوريسنسيا مرئية مع أو حتى من دون استخدام Transilluminator الأزرق قارئ الظلام. يبدأ إجراء فحص البروتياز المطور بإعداد عينات الفحص. أولاً، تحضن الركائز المؤتلفة مع الخرز المغناطيسي المتقارب، ويتم تشكيل الخرز المغناطيسي الركيزة المرفقة، المختصرة باسم SAMBs.
يتم غسلها SAMBs عدة مرات، وأخيرا يتم إعداد حل الأسهم SAMB من قبل الاقتباس منها عينات المقايسة التي يتم إنشاؤها. تتم تهيئة ردود الفعل عن طريق إضافة حل protease. عند انشقاق من قبل protease، يتم إطلاق شظايا proteolytic في افرا.
يتم إنهاء التفاعل عن طريق فصل الخرز المغناطيسي من العازلة رد الفعل الذي يحتوي على منتجات انشقاق الفلورسنت والانزيم. يتم تطبيق المنابس على آبار لوحة microtiter ويتم تحديد الفلوريسينتر بواسطة الفلوريمتر. يتم إنشاء منحنيات المعايرة باستخدام ركائز فلورية منقّاة تحل في كل مخازن المقايسة.
يتم تحديد تركيز منتجات شق الفلورسنت C-terminal وكذلك الركيزة التطبيقية في عينات الفحص بناءً على ميل منحنيات المعايرة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على جديد أو المعاد تدويره النيكل -NPA الخرز agarose المغناطيسي في المكثف الجسيمات المغناطيسية. الخرز قد التمسك الجدار و / أو في غطاء أنبوب microcentrifuge.
لذلك، بدوره المكثف رأسا على عقب في كل اتجاه للتأكد من أن يتم جمع كل من الخرز. إزالة ناظر وتجاهله. إضافة 1.8 milliliters تحلل العازلة إلى الخرز وإزالة أنابيب مغلقة من المكثف.
تعليق الخرز في أنبوب عن طريق هز و / أو تحول أنبوب رأسا على عقب حتى الخرز متجانسة تماما. ضع الأنابيب مرة أخرى في المكثف وتحويلها رأسا على عقب في كل اتجاه للتأكد من أن يتم جمع كل من الخرز. افتح الأنبوب وتجاهل المابير.
إضافة مسح البكتيريا المعقمة lysate التي تحتوي على الركيزة من الفائدة وإزالة أنبوب مغلق من المكثف. بدوره الأنابيب رأسا على عقب حتى الخرز متجانسة تماما وتدوير الأنابيب عن طريق الدوار، ببطء، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تظهر SAMBs الفلورية المرئية باستخدام أو حتى بدون استخدام Transilluminator أزرق قارئ داكن.
غسل SAMBs ثلاث مرات من قبل 1.8 ملليلتر 1٪ توين 20، وغسل العازلة، ومخزن الانقسام. إضافة المخزن المؤقت إلى SAMBs غسلها لإنشاء حل مخزون SAMB. إذا كان استخدام اثنين ملليلتر البروتين المنخفضة ملزمة microcentrifuge الأنابيب، وحجم العازلة الانقسام تطبيقها يصل إلى 1.9 ملليلتر.
بعد إضافة المخزن المؤقت، لا تهز أو تنقلب الأنبوب رأساً على عقب. أغلق الأنبوب وأزله من المُركز. إعداد اثنين ملليلتر البروتين منخفضة ملزمة أنابيب microcentrifuge لعينات المقايسة.
قم بتعليق حل الأسهم SAMB حتى يصبح متجانسًا تمامًا ويقيس كمية الركيزة التي سيتم تحليلها في التفاعلات عن طريق نقل محلول أسهم SAMB على الفور إلى قوارير العينة. يُوصى بأن يكون حجم محلول الأسهم من SAMB الذي سيتم نقله من 25 إلى 300 ميكرولترات، ولكن يجب ضبطه وفقًا للتصميم التجريبي الفردي. ضع الأنابيب العينة التي تحتوي على تعليق SAMB aliquoted في المكثف.
إزالة بعناية فائقة من SAMBs وتجاهله. إزالة الأنابيب من المكثف وإضافة بعناية العازلة رد فعل ل SAMBs. حجم العازلة التفاعل المضافة هو أن تحسب وفقا للتصميم التجريبي الفردية، ولكن من المستحسن لتعيين الحجم النهائي للخليط التفاعل بين 50 و 150 ميكرولترات إذا استخدمت أنابيب مليلتر اثنين.
أغلق أغطية الأنابيب. الآن، تكون العينات جاهزة للتهيئة. إضافة محلول انزيم إلى عينات رد فعل.
اثارة الخرز بعناية عن طريق تحريك بلطف الأنابيب ووضع الأنابيب على الفور في thermoshaker تهتز بالفعل. في حالة عينات فارغة الركيزة وعينات التحكم الركيزة، إضافة العازلة الانقسام و عازلة elution على التوالي. قبل ثلاثين ثانية من نهاية الحضانة، تأخذ العينة من ثيرمشاك وتدور على الفور.
ضع الأنبوب على المكثف واترك الأنبوب يقف لمدة 15 ثانية. ويمكن تسهيل جمع SAMBs عن طريق تحريك قليلا المكثف ذهابا وإيابا. افتح الغطاء ونقل المابير بعناية إلى لوحة أو أنبوب جديد.
لا تلمس الخرز المركزة من طرف الماصات. قد يظهر الماظر المتجمع لعينات التحكم الركازة وعينات التفاعل بدرجة عالية من الانقسام الفلورية المرئية مع أو حتى بدون استخدام Transilluminator أزرق قارئ داكن. نقل مرتين 30 ميكرولترات من super عينة منفصلة إلى أسود نصف مساحة microplate.
قياس الفلوريسين بواسطة الفلوريمتر باستخدام المرشحات المناسبة وفقا للبروتين الفلورسنت المطبقة. لتنقية ركائز الفلورسنت، إعداد نفس الحل كما هو موضح سابقا، والتخلص من فوق. إضافة 400 إلى 600 ميكروليترس عازلة elution إلى SAMBs وتدوير الأنابيب بواسطة الدوار ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
نقل eluate إلى أنابيب جديدة البروتين منخفضة ملزمة microcentrifuge. وهو يظهر الفلوري واضحة للعيان مع أو بدون استخدام Transilluminator الأزرق قارئ الظلام. بعد تنقية, تبادل العازلة, وقياس محتوى البروتين, إعداد تخفيف المسلسل مزدوجة في ثماني خطوات على الأقل, سواء من elution-buffer-وحلول الركيزة الانقسام-العازلة حلها, باستخدام elution أو الانقسام العازلة لتخفيف على التوالي.
نقل 30 ميكرولترات من كل نقطة تخفيف إلى أسود نصف مساحة microplate. قياس الفلوريسين بواسطة الفلورمتر باستخدام نفس الإعدادات التي تم تطبيقها في قياس عظمى عينة المقايسة. وكمثال على معالجة البيانات، أجريت القياسات الحركية المعتمدة على الركيزة للبروتياز فيروس نقص المناعة البشرية-1 على شكل منصهر من الركازة المؤتلفة التي تقوم على ترميز موقع الانقسام بين المصفوفة والبروتينات الكبسية في سلائف البروتينات الفجوية الطبيعية.
رسم القيم تصحيح كثافة الفلورسين النسبية ضد تركيز الضروس من ركائز منقّح، حل إما الانقسام أو عازلة elution، وتنفيذ الانحدار الخطي. حساب تركيز العث لمنتجات الانقسام C-terminal في عينات التفاعل باستخدام المنحدر من منحنى المعايرة القائم على الحاجز. أيضا حساب تركيز الركيزة التطبيقية في عينات التفاعل على أساس تركيز الضروس من الركيزة مائل في عينات التحكم الركيزة باستخدام المنحدر من منحنى المعايرة العازلة elution القائم.
تم حساب قيم السرعة الأولية من كمية شظايا الانقسام في المحطة الطرفية C ثم تم رسمها على تركيز الركيزة التطبيقية. كما تم تحديد المعلمات الحركية من قبل تحليل الانحدار غير الخطي Michaelis-Menten. بعد إجراء المقايسة المغناطيسية القائمة على حبة النيكل NTA ، يمكن تحليل المُعَملات المُصنّعة بواسطة مادة الجل البولي أكرريلاميد الكهربائي أيضًا.
ومع ذلك، بجانب تحليل عينات الفحص، فمن الممكن أيضا لتحليل ركائز الفلورسنت المنقى و / أو شظايا الانقسام بعد الهضم في حل. للهضم في الحل, aliquote ركائز الفلورسنت تنقية ليتم هضمها في العازلة الانقسام في أنابيب microcentrifuge 1.5 ملليلتر, وإضافة محلول انزيم للعينات. احتضان العينات وفقا للتصميم التجريبي وإنهاء ردود الفعل عن طريق إجراء إعداد العينة لـ PAGE.
لإعداد عينة غير مُهدَّد، اخلط العينات التي سيتم تحليلها مع مخزن تحميل العينة غير المُحتوي على عوامل تقليل. في حالة إعداد العينة المشوهة ، اخلط العينات التي سيتم تحليلها مع عازل تحميل العينات وتعريض العينات للمعالجة الحرارية عند 95 درجة لمدة 10 دقائق. تطبيق العينات غير المشوهة وغير المشوهة في آبار هلام SDS-polyacrylamide وتنفيذ الكهرباء.
قم بإزالة الكاسيت هلام من وحدة تشغيل. غير التشويه العينات مرئية بالفعل في هلام حتى بالعين المجردة أو مع Transilluminator الأزرق القارئ المظلم. من أجل الكشف عن المكونات الفلورية للعينات المشوهة على الترانسيليميناتور، قم بإجراء الرناتونات في هلام عن طريق غسل SDS من الجل.
إضافة 100 ملليلتر الماء المقطر إلى هلام وشطفه على الأقل لمدة 30 دقيقة. تصور البروتينات الفلورسنت عن طريق وضع هلام غير المطّع على transilluminator الأزرق القارئ المظلم. تم تصميم بروتينات الانصهار الفلورسنت المؤتلف لاستخدامها كركائز في المقايسات البروتينية.
عند انشقاق من قبل protease في موقع انشقاق محددة، يتم تحرير جزء من شق الفلورسنت C-محطة ويمكن الكشف عن الفلوريسنس. وقد تم تحسين استخدامها في المقايسة المغناطيسية القائمة على حبة النيكل NTA والكشف الفلوري من قبل تحليل PAGE باستخدام بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية-1. ومع ذلك، يمكن أن تكون منصة فحص المتقدمة مناسبة للبروتيازات الأخرى كذلك.
يتم توضيح منحنيات المعايرة من ركائز منقّح حلها في الانقسام أو عازلة elution على أمثلة من كل من mTurquoise-2-و mEYFP-تنصهر شكل الركيزة المؤتلفة ترميز الجانب الانقسام بين المصفوفة والبروتينات capsid من البروتين الأنفي فيروس نقص المناعة البشرية الطبيعي. النيكل NTA المغناطيسي الخرز القائم على مقايسة هو أداة مفيدة لدراسة تأثير تركيز الركيزة على سرعة التفاعل ، وبالتالي يجعل أيضا تحديد المعلمات الحركية انزيم مثل Vmax و كم ممكن. الرسم البياني أ يظهر نتيجة مثالية تم الحصول عليها بعد تحليل بنجاح من النشاط المعتمد على الركيزة على الركيزة mApple تنصهر.
وعلى النقيض من ذلك، يقدم الرسم البياني باء نتيجة دون المستوى الأمثل حيث يؤدي التجانس غير الكافي لحل الأسهم SAMB إلى حدوث مشاكل في إعداد تركيزات الركيزة المناسبة بينما يؤدي الإنهاء غير السليم لعينات التفاعل إلى أخطاء عالية نسبياً. كما يوفر الفحص أداة مناسبة لإجراء دراسات الوقت والمثبطة كذلك. الرسم البياني ألف يوضح الاعتماد الوقت من الانقسام proteolytic من فيروس نقص المناعة البشرية-1 protease على الركيزة ميزونت-mEYFP، في حين يمثل الرسم البياني B تأثير مثبط من أمبيرنافير على رد فعل الانقسام.
من البيانات التي تم الحصول عليها من قبل الدراسة المثبطة ، يمكن تحديد كل من تركيز الإنزيم النشط وثابت المثبط. ويمكن أيضا أن يكون الأمثل للمحسين لدراسة الاعتماد على نشاط انزيم على الأسى، كما هو يمثله الرسم البياني أ على سبيل المثال من فيروس حفر التبغ بروتياز. الرسم البياني باء يشير إلى وجود قيود على الفحص من قبل درجة الحموضة ويظهر أن درجة الحموضة المحايدة أو القلوية قليلا يتوافق تماما مع القياسات، في حين أن الأسيحامي يسهل الانفصال التلقائي للركائز من سطح الخرز المغناطيسي.
ويبين الشكل الحالي ركائز الفلورسنت النقية سليمة، وشظايا انشقاق الفلورسنت C الطرفية، ولدت عن طريق الهضم في حل من قبل بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية-1. ويمكن الكشف عن المكونات الفلورية في هلام البولي أكرريلاميد المحتوي على SDS بواسطة الترانسيلومينات الضوء الأزرق الحق بعد الكهربائي إذا تم تطبيق شروط عدم denaturing أثناء إعداد العينة. يمكن تمييز البروتينات الفلورية المختلفة على أساس لونها.
بعد المقايسة المغناطيسية القائمة على الخرز ، يمكن الكشف عن البروتينات الفلورية غير المشهنة في عينات من فوق المنابس في الجل عن طريق إضاءة الأشعة فوق البنفسجية أيضًا. في المقابل، إذا تم تطبيق شروط denaturing أثناء إعداد العينة، لا يمكن الكشف عن البروتينات المشوهة في الجل مباشرة بعد صفحة SDS. ومع ذلك، يمكن أن تكون البروتينات الفلورية المشوهة جزئيًا من خلال إزالة SDS من الجل وتصبح قابلة للكشف.
ولذلك، يتبع صفحة SDS بإجراء الرناتات في هلام. قدرة الريناتون من البروتينات الفلورية يجعل من الممكن تحديدها ليس فقط على أساس الفلوريسنس ولكن أيضا على أساس وزنها الجزيئي. هنا أظهرنا البروتوكول لاستخدام لدينا مؤخرا التي وضعت الخرز المغناطيسي القائم على منصة المقايسة الفلورية.
وقد أثبتنا استخدام هذا النظام على سبيل المثال الدراسات الحركية الانزيمية على فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروتياز. استخدمنا mTurquoise-و mApple-تنصهر أشكال من الركيزة المؤتلفة، والتي تحتوي على تسلسل موقع الانقسام من protease. وإلى جانب التحليل الفلوري، تم تحليل عينات المعايرة في وقت لاحق من قبل SDS PAGE أيضا.
لقد أثبتنا أن البروتينات الفلورية المشوهة يمكن أن تكون مجزأة جزئيًا في الجل بعد SDS PAGE التي توفر تحديدًا قائمًا على الفلورسنت والوزن الجزيئي للركيزة والشظايا البروتينية.
