لقد أظهرنا أن الجينوم الفيروسي المجموعة الرابعة ترميز فترات قصيرة من تسلسل البروتين المضيف. ويمكن العثور على هذه التسلسلات داخل مواقع الانقسام البروتياز الفيروسية. يتم استخدامها لتدمير مستهدف للبروتينات المضيفة ، وعادة ما تشارك البروتينات في توليد الاستجابات المناعية.
ميزة رئيسية لاستخدام المقايسات protease هو أنه يزيل تعقيد الخلية ويظهر ما إذا كان أو لم يكن protease الفيروسية يمكن أن تشد تسلسل معين. لذلك عندما حللنا متواليات زيكا SSHHPS ، وجدنا أن البروتياز يمكن أن يقطع تسلسلات في البروتينات المشاركة في توليد استجابات المناعة وأن بعض هذه البروتينات لها أيضًا أدوار في نمو الدماغ والعين. عند تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، ينبغي للمرء أن نتذكر أنه إذا لم يتم ملاحظة الانقسام، وأنه قد يكون بسبب مجموعة متنوعة من العوامل مثل نشاط البروتياز.
(سيبرهن على العملية سيكون (جايمي كومبتون ، فني من مختبري تبدأ من خلال فتح البروتين BLAST ووضع الأحماض الأمينية 20 المحيطة السندات scissile والبوليبروتين الفيروسية وحدد تسلسل البروتين غير زائدة عن الحاجة ثم اكتب في الجينوم المضيف ليتم البحث فيها. إذا لزم الأمر، حدد PHI-BLAST واكتب في تسلسل نمط حيث تشير الأقواس المربعة إلى أن إما الأحماض الأمينية داخل الأقواس يمكن أن تكون في موقف بديل، ثم ضرب انفجار.
ترتيب رتبة يضرب انفجار استناداً إلى عدد من المخلفات المتطابقة أو المتسامحة المتتالية التي تطابق تسلسل موقع الانقسام. من القائمة، حدد البروتينات التي تحتوي على ستة أو أكثر من المخلفات متطابقة أو مماثلة للتحليل في مقايسات البروتياز. بناء بلازميد ترميز بروتين الفلورسنت السماوي، ما يصل إلى 25 الأحماض الأمينية من تسلسل الانقسام، والبروتين الفلورسنت الأصفر.
المقبل, إعداد ركائز CFP وYFP عن طريق تلقيح أربع قارورة أربعة لتر مع 25 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها. هز الثقافات في 37 درجة مئوية ورصد النمو كل ساعة من قبل الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي في 600 نانومتر. عندما تصل البكتيريا إلى امتصاص حوالي واحد ، تحث على التعبير البروتيني عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من IPTG مولور واحد إلى كل قارورة ، ثم خفض درجة حرارة الحاضنة المرتجفة إلى 17 درجة مئوية والسماح بالتعبير بالاستمرار بين عشية وضحاها لمدة 17 إلى 20 ساعة.
في اليوم التالي، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 7000 مرات ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام السائل ثم تخزين الكريات في ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما مع تحلل الخلية. لتحلل الخلايا ، وإعداد 100 ملليلتر من العازلة تحلل وفقا لاتجاهات المخطوطات ، resuspend الكريات في العازلة ، ونقل 25 إلى 25 ملليلتر من التعليق إلى 50 ملليلتر أنابيب مخروطية يمكن التخلص منها.
ضع الأنابيب في زجاجة بلاستيكية مع ماء جليدي ثم أدخل طرف sonicator في الأنبوب بحيث تكون الحافة حوالي سنتيمتر واحد من أسفل الأنبوب و sonicate lysate 10 إلى 20 مرة حتى يصبح سائلًا وسيلًا. بعد سونيكيشن، نقل lysate إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة والطرد المركزي في 20، 500 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل ناظر إلى زجاجة نظيفة والتخلص من الكريات.
تحميل lysate على عمود النيكل ثم غسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من العازلة A تليها خمسة مجلدات العمود من 20٪ المخزن المؤقت B.Absorbance في 280 سوف يزيد نانومتر خلال الغسيل كما الملوثات elute من العمود. استمر في الغسل حتى يعود A280 إلى قيم الأساس. ثم قمل البروتين مع اثنين إلى ثلاثة مجلدات العمود من 100٪ العازلة B وجمع 10 ملليلتر الكسور، مع التأكد من قياس A280 من كل كسر.
إعداد ثمانية ردود فعل يمزج وفقا لاتجاهات المخطوطات والماصات 45 ميكرولترات من كل مزيج في الآبار الثلاثة الأولى من كل صف من لوحة سوداء نصف مساحة 96 جيدا. إعداد قارئ لوحة للكشف في وقت واحد من فلوريسنس في أطوال موجية اثنين مع إعداد أنبوب الmultiplier ثابت. قم ببرمجة وقت القراءة إلى 20 إلى 30 دقيقة مع قراءة واحدة في الدقيقة وحدد الآبار التي سيتم قراءتها.
أدخل اللوحة في الجهاز وابدأ القراءة، ومراقبة نسب الانبعاثات بمرور الوقت. تشغيل نقطة نهاية قراءة لوحة تحتوي على الركيزة غير المصقول. إزالة لوحة وماصة خمسة ميكروليترس من الانزيم في كل بئر.
يمكن للمرء حفظ العمود الأول كتحكم غير مقطوع. ثم اقرأ اللوحة مرة أخرى لمدة 20 إلى 30 دقيقة ، مع التأكد من تعيين قارئ اللوحة لإخراج القيم المطلقة. بمجرد الانتهاء من القراءة، وختم لوحة مع الفيلم لمنع التبخر وتركها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنزيم لخفض الركيزة تماما.
بعد 24 ساعة، قم بإزالة الفيلم واؤد نقطة نهاية مقروءة من اللوحة. متوسط نسب الانبعاثات وتسجيلها كقطع. تأكيد انشقاق الركيزة باستخدام SDS-PAGE.
تحميل علامة الوزن الجزيئي في حارة الأولى أو الأخيرة وتحميل خمسة ميكرولترات من كل خليط التفاعل في حارة من هلام، بدءا من رد فعل غير المصقول. قم بتوصيل أقطاب خزان الجل إلى مصدر الطاقة وتشغيل المنتجات بقوة 110 فولت لمدة 60 دقيقة. إزالة هلام من الكاسيت باستخدام أداة تكسير وغمره في خمسة إلى 10 ملليلتر من حل تلطيخ.
بعد ساعة إلى 24 ساعة، وإزالة وصمة عار الزائدة وغمر الجل في الماء. ثم التقاط صورة من هلام باستخدام صورة هلام. لتحضير بنية البروتين، قم بتحميل ملف البروتين PDB في وزارة التربية.
انقر فوق تحديد والمذيبات، ثم حذف المذيبات. افتح لوحة pPreparation Structure من شريط القائمة العلوي Compute ثم قم بتصحيح كافة العناصر الإنشائية تلقائيًا بالنقر على تصحيح. بروتونات الهيكل بالنقر على بروتونات 3D.
إضافة رسوم جزئية إلى البروتين عن طريق فتح لوحة التكاليف الجزئية واختيار AMBER 99 وضبط الهيدروجين ولأزواج وحيد كما هو مطلوب. ثم احفظ ملف البنية. لبناء هيكل للببتيدات الركيزة و TRIM14، افتح لوحة منشئ البروتين، وأدخل تسلسل الركيزة، وحدد إعادة حزم تلقائي.
بعد ذلك، قم بتعيين الهندسة كما الموسعة وانقر على بناء. وأخيراً تقليل الهيكل وحفظه كملف PDB. إرساء الببتيدات الركيزة لEV-nsP2 باستخدام PyRx AudoDock 4.2 البرمجيات.
قم بتحميل البروتين، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الاسم، وحدد جعل ماكروموليكول لإعداد ملف الإرساء PDBQT. ثم قم بتحميل جزيء الركيزة وحدد جعل ليجند لإعداد ملف الالتحام ليغاند. بدء تشغيل معالج AutoDock على لوحة الإرساء في الجزء السفلي وحدد ملفات ligand والبروتين المعدة.
تعريف جيب ربط البروتين عن طريق ضبط يدويا البعد الشبكة، ثم تشغيل AuotGrid. بعد ذلك، قم بتشغيل AutoDock وحدد أسلوب الخوارزمية الوراثية لاماركيان. انقر فوق المعلمات الإرساء وتعيين عدد من تشغيل الجمعية العامة إلى 50 ثم انقر فوق إلى الأمام لبدء تشغيل الإرساء.
عند اكتمال AutoDock، افتح لوحة تحليل النتائج ثم تفقد كافة الأوضاع الربط المتوقعة. حدد أفضل نموذج مع الطاقة الربط المتوقع أقل والتفاعلات ملزمة معقولة بين رابطة الدول المستقلة-477 والركيزة على موقع الانقسام ثم حفظه كملف PDB لمزيد من المحاكاة MD. بعد قراءة وضعيات الربط باستخدام AutoDock، من المهم إجراء تحليل ما بعد الإرساء لتحديد نموذج الربط المعقول للصقل باستخدام محاكاة MD.
وقد استخدم هذا البروتوكول للعثور على فترات قصيرة من متواليات البروتين المُضيفة المسببة للأمراض المتجانسة أو SSHHPS في فيروس زيكا ns2B/3 protease. وتم تحديد أربعة أهداف للبروتين المضيف. FOXGS, SFRP1, وحدة فرعية Gsalpha من مكتبة cDNA شبكية العين, وNT5M الميتوكوندريا 5'3'nucleotidase.
سمحت محاذاة التسلسل لـ SSHHPS بالاختلافات الخاصة بالأنواع في تسلسل موقع الانقسام. وكان تسلسل SFRP1 متطابقاً في البشر والدجاج، وهو أمر جدير بالملاحظة لأن فيروس زيكا يمكن أن يؤدي إلى الوفيات وصغر الرأس في أجنة الدجاج. واستخدمت المقايسة المستمرة لقياس المعلمات الحركية الثابتة الحالة وثوابت تثبيط لتسلسلات البوليبروتين الفيروسية واستخدمت المقايسة المستمرة للحصول على معلومات انشقاق نوعية، مثل انشقاق تسلسل معين أو تثبيط البروتياز من قبل مركبات مختلفة.
وقدم نموذج لالتهاب الدماغ الخيول الفنزويلي nsP1-nsP2 تقاطع باستخدام في أساليب السيليكو. بالنسبة لـ NsP2 protease ، أدى إطالة تسلسل الركيزة وتقليل القوة الأيونية للمخزن المؤقت إلى انخفاض كبير في ثابت Michaelis من انشقاق تسلسل فيروس غابة Semliki. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم تشغيل عناصر التحكم.
يجب اختبار الركائز التي تحتوي على تسلسلات موقع شق البروتياز الفيروسي قبل الشروع في تحليل تسلسل SSHHPS. إذا لوحظ انشقاق البروتين المضيف، ينبغي إجراء تجارب المتابعة للتأكد من أن هذا البروتين المضيف يؤثر على النسخ الفيروسي. ويمكن القيام بذلك عن طريق الإفراط في التعبير عن البروتين أو إسكاته ، ومن ثم فحص الآثار على تكرار الفيروسية.
المجموعة الرابعة تحتوي على عدد كبير من مسببات الأمراض الجديدة والناشئة. وصلات تسلسل SSHHPS بروتينات محددة المضيف والمسارات مع البروتياز الفيروسية بطريقة يمكن التنبؤ بها للغاية.
