لدينا تحليل عالية الإنتاجية يضيف إلى الطرق المتاحة لتحديد الجزيئات الصغيرة وأهدافها التي تعدل TCR الإشارات وتفعيل T-الخلية. لدينا مقايسة لها جانب تصحيحية الذاتي من خلال تصفية المركبات السامة وتحديد مثبطات إشارات TCR والحث على التحفيز المبرمج. تحديد وسطاء من TCR الإشارات يمكن أن تساعد في التطورات العلاج للأمراض المناعية.
قدمنا حافزا قويا للثثى المشتقة من الفئران البولي كلينال TCR. من الممكن استخدام فئران تحويلية TCR وتنشيطها مع رباعيات ليغاند الببتيد الأخرى لتحفيز أضعف. هذا مقايسة يتضمّن الإستعمال من حجيس صغيرة ولوحات صغيرة حجم ل زراعة من الخلايا.
وهذا يتطلب التعامل الدقيق مع لوحات ومحتوياتها. هناك العديد من المركبات في مكتبة مثبطات كيناز التي تعتبر خطرة. لاعتبارات السلامة، تعامل جميع المركبات على أنها خطرة على قدم المساواة، واتبع احتياطات السلامة الموصى بها من قبل المورد.
لبدء علاج الخلايا الزعتية مع مثبطات كيناز، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 40 ميكرولترات لكل بئر من الخلايا الزعتية إلى لوحة صغيرة الحجم. ضع الصحن على الثلج ثم ماص واحد جزء من مثبطات كيناز، DMSO، و ديكساميثازون، وأربعة أجزاء من وسائل الإعلام دورةنع أو حاسب بالكاونية في لوحة 96 جيدا.
تعيين ثمانية آبار من الصفيحة الصغيرة الحجم لضوابط غير معالجة، وأربع آبار لضوابط إيجابية المعالجة بالديكساميثاسون لموت الخلايا عن طريق إضافة ديكساميثازون المخفف في تركيز الخمسة ميكرومولار، وأربع آبار إلى أجهزة التحكم المعالجة بالمركبات، عن طريق إضافة 0.5 ميكرولترات من DMSO المخفف. بعد ذلك ، من الآبار المقابلة من لوحة المانع ، أضف 0.5 ميكرولترات من كل مثبط مخفف إلى لوحة 96 بئرًا. لبدء التحفيز الزعتر، تأكد أولاً من أن الخرز المضاد للأقراص المضغوطة 3 و CD-28 يتم تعليقه بشكل موحد.
بعد ذلك ، قم بغسل ملليلتر واحد من الخرز بمليلترين من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. وضع أنبوب على موقف مغناطيسي لفصل الخرز من افرحة وpirpirate الحل. ثم إعادة تعليق الخرز في ملليلتر واحد من المتوسط دورة ً كاملة.
أضف 10 ميكرولترات لكل بئر من التعليق الخرز إلى كل عينة معالجة من مثبطات، وأربع عينات معالجة DMSO، وأربع من العينات الثماني غير المعالجة. أضف 10 ميكرولترات من الـ RPMI الكامل إلى الآبار الأربعة المتبقية غير المعالجة. استخدام شاكر المداري microplate لتهيج بلطف لوحة.
بعد ذلك، احتضان الخلايا الزعتية في 37 درجة مئوية و 5٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 17 إلى 20 ساعة، أو بين عشية وضحاها. رئيس لوحة تدفق لاريمل الآلي غسالة، أولا مع 150 ملليلتر من محلول الإيثانول توين، ثم مع المياه غير المؤينة تكمل مع 1٪ توين 20، وأخيرا، مع FACS غسل العازلة. في نهاية الحضانة باستخدام نظام غسالة لوحة، وغسل لوحة مع FACS غسل العازلة باستخدام دورة الغسيل تسع مرات.
كل غسل يضيف ويزيل 55 ميكرولترات من عازلة غسل عن طريق تدفق لاريبار، مما أدى إلى إضعاف الأسي من الكواشف في الآبار. لطخ مستضدات السطح، أولا تخفيف وحدة واحدة حجم المضادة للأقراص المدمجة-3، المضادة للأقراص المضغوطة-4، المضادة للأقراص المضغوطة-8، ومضادة للأقراص المضغوطة-69 الأجسام المضادة في 100 وحدة من وحدات التخزين المؤقت غسل FACS. ثم إعادة تعليق الخلايا في 25 ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة تلطيخ.
استخدم شاكر مداري microplate لإثارة اللوحة بلطف ، ثم اترك اللوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة. لإصلاح الخلايا، أولا غسل لوحة مع 55 ميكرولترات من FACS غسل العازلة باستخدام دورة الغسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل. ثم إضافة 50 ميكرولتررس من العازلة التثبيت - impermeablization إلى كل بئر.
اخلطي جيداً ويحضني الصحن على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وإعداد بيرم X واحد وغسل العازلة عن طريق تخفيف 25 ملليلتر من المخزون 10X المقدمة في 225 ملليلتر من المياه Ultrapure. رئيس غسالة لوحة مع واحد X العازلة وغسل لوحة مع 55 ميكروليتر من المخزن المؤقت واحد X باستخدام دورة الغسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل.
للبدء، مزيج ملليلتر واحد من الأجسام المضادة caspase 3 مع مليلترين من بيرم X واحد وغسل العازلة. إضافة 25 ميكرولتر في بئر من الخليط إلى الخلايا الثابتة. استخدام شاكر المداري microplate لتهيج بلطف لوحة.
اتركي الصحن على الثلج لمدة ساعة في نهاية الحضانة، كرر خطوة الغسيل تسع مرات مع بيرم واحد X وغسل العازلة. ثم إضافة 25 ميكرولترات من FACS غسل العازلة إلى جميع الآبار من لوحة.
الماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط الحل. وأخيراً، نقل العينات المختلطة إلى أنابيب microtiter. قم بالأنابيب مع عازل غسل FACS إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر، والمضي قدما في تحليل تدفق القياسات الكيسية.
وبعد أن تم رصد مضادة للأقراص المدمجة-3، وCD-28، لوحظت زيادة في تنشيط الكاسباس-3، وفي نظام الدوائي TCR في كل من العينات غير المعالجة وعينات DMSO التي تم علاجها بالسخرية. ولوحظ أيضاً زيادة في التعبير CD-69 في كلتا العينتين المحفّزتين. وأظهرت العينات المعالجة dexamethasone زيادة في تنشيط caspase-3 مستقلة عن upregulation CD-69، كما هو متوقع للتأثير المستحثة تخثر الدم المستقلة وتحفيز TCR.
وقد تبين ضعف انتقائي لظواهر تنشيط الخلايا التى من خلال مثبطات مختلفة إما قمعت كلا من تنشيط كاسباس -3 وCD-69 حتى التنظيم، أو CD-69 حتى التنظيم، ولكن لم يضعف التنشيط caspase-3. وكانت هناك أيضا مثبطات لم تستهدف كيناز ذات الصلة من مسار إشارة TCR، وبالتالي لم قمع كل من رفع التراكم CD-69 وتنشيط caspase-3. وأظهرت نتيجة الشاشة من staurosporine، والسيطرة على المبرمج إيجابية، مستويات عالية من التنشيط caspase-3، كما هو متوقع.
ومع ذلك، أظهرت النتيجة أيضا مستويات منخفضة من التعبير CD-69 التي يمكن أن تعزى إلى تثبيطها بوساطة من بروتين كيناز C أو ه موت الخلايا المبرمج المستحثة قبل التعبير CD-69. وأظهرت المقارنة بين بروتوكولات فحص مختلفة أي اختلافات في caspase-3 النشطة، CD-69، وتلطيخ TCR من السيطرة السلبية، والسيطرة الإيجابية للوفاة الخلية، ومراقبة السيارة، وعينة المعالجة بالمثبطات. وتهدف مراحل ما قبل الحضانة إلى تسهيل استخدام لوحة صغيرة الحجم لمعالجة الخلايا.
كما يتم توفير البروتوكول القياسي المعتمد على الطرد المركزي في المخطوطة. يمكن التحقق من صحة مثبطات أو أهداف مثيرة للاهتمام باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا وكذلك في أنواع مختلفة، مثل الخلايا الليمفاوية الماوس pagopheral أو الخلايا الأولية البشرية. ويمكن أن يساعد التوصيف اللاحق للجزيئات المحددة والأهداف في تحسين فهم بيولوجيا الخلايا التاتية والتوسع في الأهداف المحتملة للتحـدّم المناعي.
