Yüksek iş yapma lı araştırmamız, TCR sinyalizasyonunu ve T-hücre aktivasyonunu modüle eden küçük moleküllerin ve hedeflerinin tanımlanması için mevcut yöntemleri ekler. Bizim tsay toksik bileşikler filtreleme ve TCR sinyalve stimülasyon kaynaklı apoptoz inhibitörlerini tespit yoluyla kendini düzeltici bir yönü vardır. TCR sinyallerinin arabulucularının belirlenmesi bağışıklık hastalıkları için tedavi gelişmelerine yardımcı olabilir.
TCR-poliklonal farelerden elde edilen timositler için güçlü bir uyarıcı sağladık. TCR-transgenik farelerkullanmak ve daha zayıf stimülasyon için diğer peptid ligand tetramerleri ile uyarmak mümkündür. Bu teşp, hücrelerin kültüre atılması için küçük hacimli ve küçük hacimli plakaların kullanımını içerir.
Bu, plakaların ve içeriğinin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirir. Kiyaz inhibitörleri kütüphanesinde tehlikeli olarak kabul edilen birçok bileşik vardır. Güvenlik hususları için, tüm bileşikleri eşit derecede tehlikeli olarak ele alın ve tedarikçinin tavsiye edilen güvenlik önlemlerine uyun.
Kiyazı inhibitörleri ile timositlerin tedavisine başlamak için, küçük hacimli bir plaka ya timositler kuyu başına 40 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. Tabağı buza koy. Sonra pipet kiaz inhibitörleri bir parçası, DMSO, ve deksametazon, ve 96-iyi plaka içine tam RPMI medya dört parça.
Küçük hacimli plakanın sekiz kuyuyu işlenmemiş kontrollere, dört kuyuyu beş mikromolar konsantrasyonuna seyreltilmiş deksametazon ekleyerek hücre ölümü için deksametazon la tedavi edilmiş pozitif kontrollere ve seyreltilmiş DMSO'nun 0,5 mikrolitresini ekleyerek araç la ilgili kontrollere dört kuyu belirleyin. Daha sonra, inhibitör plakanın ilgili kuyularından, 96 kuyulu plakaya seyreltilmiş inhibitörün 0,5 mikrolitresini ekleyin. Timosit stimülasyonuna başlamak için, önce anti-CD-3 ve CD-28 boncuklarının düzgün bir şekilde yeniden askıya alındıklarına emin olun.
Daha sonra, pbs tampon iki mililitre ile boncuk bir mililitre yıkayın. Supernatant boncuk ayırmak ve çözelti aspire için bir manyetik stand üzerine tüp koyun. Sonra tam RPMI orta bir mililitre boncuk yeniden askıya.
Her inhibitör tedavi edilen numuneye boncuk süspansiyonunun kuyubaşına 10 mikrolitre, DMSO tarafından tedavi edilen dört örnek ve tedavi edilmemiş sekiz numuneden dördüne ekleyin. Kalan dört tedavi edilmemiş kuyuya tam RPMI 10 mikrolitre ekleyin. Plakayı hafifçe karıştırmak için bir mikroplaka orbital shaker kullanın.
Daha sonra, timositleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit ortamında 17 ila 20 saat veya bir gecede kuluçkaya yatırın. Prime otomatik laminar akış plakası yıkayıcı, ilk etanol Tween çözeltisi 150 mililitre ile, sonra deiyonize su ile takviye 1%Tween 20, ve son olarak, FACS yıkama tampon ile. Plaka yıkama sistemi kullanılarak kuluçka sonunda, dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak FACS yıkama tampon ile plaka yıkayın.
Her yıkama, laminar akış labirlikte 55 mikrolitre yıkama tamponu ekler ve kaldırır ve kuyularda reaktiflerin üstel seyreltilmesine neden olur. Yüzey antijenlerini lekelemek için, ilk olarak bir birim anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 ve facs yıkama tamponunun 100 birimlik hacimlerinde anti-CD-69 antikorlarını seyreltin. Daha sonra boyama antikor karışımı 25 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Plakayı hafifçe karıştırmak için mikroplakalı bir orbital shaker kullanın ve sonra plakayı 30 dakika buzüzerinde bırakın. Hücreleri düzeltmek için, önce daha önce açıklandığı gibi dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak FACS yıkama tampon 55 mikrolitre ile plaka yıkayın. Sonra her kuyuya fiksasyon-impermeablization tampon 50 mikrolitre ekleyin.
İyi bir şekilde karıştırın ve tabağı 30 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 225 mililitre Ultrapure suda sağlanan 10X stokun 25 mililitresini seyrelterek bir x perma hazırlayın ve tamponu yıkayın. Plakayı tek X tamponla asal olarak layın ve daha önce açıklandığı gibi dokuz kez yıkama döngüsü kullanarak plakayı 55 mikrolitre bir x tamponla yıkayın.
Başlamak için, bir mililitre anti-caspase 3 antikor ile bir mililitre bir-X perm ve yıkama tampon iki mililitre karıştırın. Sabit hücrelere karışımın kuyu başına 25 mikrolitre ekleyin. Plakayı hafifçe karıştırmak için bir mikroplaka orbital shaker kullanın.
Tabağı bir saat buzda bırak. Kuluçka sonunda, bir-X perma ve yıkama tampon uyla yıkama adımını dokuz kez tekrarlayın. Sonra plaka tüm kuyulara FACS yıkama tampon 25 mikrolitre ekleyin.
Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez çözüm karıştırmak için. Son olarak, mikrotiter tüpler içine karışık örnekleri aktarın. FACS yıkama tamponu ile tüpleri toplam 200 mikrolitre hacimde toplayın ve akış sitometri analizine devam edin.
Anti-CD-3, CD-28 stimülasyonu, hem tedavi edilmeyen hem de DMSO mock-treated örneklerinde kaspas-3 aktivasyonunda ve TCR downregülasyonunda artış gözlendi. Ayrıca her iki uyarılmış örnekte de CD-69 ekspresyonunda artış gözlendi. Deksametazon ile tedavi edilen örneklerde, bağımsız apoptoz indükleme etkisi ve TCR stimülasyonu nda beklendiği gibi CD-69 upregülasyonundan bağımsız kaspaz-3 aktivasyonunda artış saptandı.
T-hücre aktivasyon fenomenlerinin selektif bozukluğu, hem caspase-3 aktivasyonunu hem de CD-69 up-regülasyonunu baskılayan veya CD-69 up-regülasyonunu engelleyen, ancak caspase-3 aktivasyonunu bozmayan farklı inhibitörler tarafından gösterilmiştir. Ayrıca TCR-sinyal yolunun ilgili bir kimyazını hedeflemeyan inhibitörler vardı ve bu nedenle hem CD-69 upregülasyonunu hem de caspase-3 aktivasyonunu bastırmadı. Staurosporinin ekran sonucu, apoptoz-pozitif kontrol, beklendiği gibi, caspase-3 aktivasyonu yüksek düzeyde gösterdi.
Ancak, sonuç aynı zamanda CD-69 ekspresyonu önce protein kiaz C veya indüklenen apoptoz aracılı inhibisyonu atfedilebilir CD-69 ifade düşük düzeyde gösterdi. Farklı test protokollerinin karşılaştırılmasında aktif kaspas-3, CD-69 ve TCR boyama, hücre ölümü için pozitif kontrol, araç kontrolü ve inhibitör le tedavi edilen örneklemde herhangi bir fark saptanmama saptandı. Pre-kuluçka aşamaları hücrelerin kültüriçin küçük hacimli plaka kullanımını kolaylaştırmak içindir.
Makalede standart santrifüje bağımlı protokol de sağlanmaktadır. Potansiyel olarak ilginç inhibitörleri veya hedefleri farklı hücre tipleri kullanılarak doğrulanabilir ve ayrıca farklı türlerde, pagopheral fare lenfositler veya insan birincil hücreleri gibi. Tanımlanan moleküllerin ve hedeflerin daha sonraki karakterizasyonu T-hücre biyolojisinin anlaşılmasını geliştirmeye ve immünomodülasyon için olası hedeflerin genişletilmesine yardımcı olabilir.
