Notre analyse à haut débit s’ajoute aux méthodes disponibles pour l’identification des petites molécules et de leurs cibles qui modulent la signalisation TCR et l’activation des cellules T. Notre analyse a un aspect auto-correcteur en filtrant les composés toxiques et en identifiant les inhibiteurs de la signalisation TCR et de l’apoptose induite par la stimulation. L’identification des médiateurs de la signalisation de TCR peut aider dans les développements de la thérapie pour des maladies immunisées.
Nous avons fourni un stimulus fort pour des thymocytes dérivés des souris TCR-polyclonal. Il est possible d’utiliser des souris transgéniques TCR et de les stimuler avec d’autres tétramers ligand peptidiques pour une stimulation plus faible. Cet essai implique l’utilisation de petits volumes et de plaques à petit volume pour la culture des cellules.
Cela nécessite une manipulation minutieuse des plaques et de son contenu. Il existe de nombreux composés dans la bibliothèque des inhibiteurs de la kinase qui sont considérés comme dangereux. Pour des raisons de sécurité, traitez tous les composés comme étant tout aussi dangereux et suivez les précautions de sécurité recommandées par le fournisseur.
Pour commencer le traitement des thymocytes avec des inhibiteurs de la kinase, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 40 microlitres par puits de thymocytes à une plaque à petit volume. Mettez la plaque sur la glace. Puis pipette une partie des inhibiteurs de kinase, DMSO, et dexaméthasone, et quatre parties du média complet de RPMI dans une plaque de 96 puits.
Désigner huit puits de la plaque à petit volume à des témoins non traités, quatre puits pour les contrôles positifs traités par la désxaméthasone pour la mort cellulaire en ajoutant la dexaméthasone diluée à la concentration de cinq micromolaires, et quatre puits aux commandes traitées par le véhicule, en ajoutant 0,5 microlitres de la DMSO diluée. Ensuite, à partir des puits correspondants de la plaque inhibitrice, ajouter 0,5 microlitres de chaque inhibiteur dilué à la plaque de 96 puits. Pour commencer la stimulation des thymocytes, assurez-vous d’abord que les perles anti-CD-3 et CD-28 sont uniformément re-suspendues.
Ensuite, lavez un millilitre des perles avec deux millilitres du tampon PBS. Mettez le tube sur un support magnétique pour séparer les perles du surnatant et aspirer la solution. Suspendez ensuite les perles en un millilitre du milieu complet du RPMI.
Ajouter 10 microlitres par puits de la suspension de perle à chaque échantillon traité par inhibiteur, les quatre échantillons traités par DMSO et quatre des huit échantillons non traités. Ajouter 10 microlitres de l’IRM complète aux quatre autres puits non traités. Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque.
Ensuite, incuber les thymocytes en 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant 17 à 20 heures, ou pendant la nuit. Prime une laveuse automatique de plaque d’écoulement laminaire, d’abord avec 150 millilitres de solution d’éthanol Tween, puis avec de l’eau déionisée complétée par 1%Tween 20, et enfin, avec tampon de lavage FACS. À la fin de l’incubation à l’aide du système de lave-plaques, lavez la plaque avec un tampon de lavage FACS à l’aide d’un cycle de lavage neuf fois.
Chaque lavage ajoute et élimine 55 microlitres de tampon de lavage par écoulement laminaire, ce qui entraîne une dilution exponentielle des reagents dans les puits. Pour tacher les antigènes de surface, diluez d’abord un volume unitaire d’anticorps anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 et anti-CD-69 dans des volumes de 100 unités du tampon de lavage FACS. Puis suspendre à nouveau les cellules dans 25 microlitres du mélange d’anticorps soudants.
Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque, puis laissez la plaque sur la glace pendant 30 minutes. Pour fixer les cellules, lavez d’abord la plaque avec 55 microlitres de tampon de lavage FACS en utilisant neuf fois le cycle de lavage tel que décrit précédemment. Ajouter ensuite 50 microlitres du tampon fixation-impermébation à chaque puits.
Bien mélanger et incuber la plaque sur la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, préparer un perm one-X et laver le tampon en diluant 25 millilitres du stock fourni de 10X en 225 millilitres d’eau Ultrapure. Amorcez la laveuse à plaques avec un tampon X et lavez la plaque avec 55 microlitres du tampon one-X à l’aide d’un cycle de lavage neuf fois tel que décrit précédemment.
Pour commencer, mélangez un millilitre de l’anticorps anti-caspase 3 avec deux millilitres du perm one-X et du tampon de lavage. Ajouter 25 microlitres par puits du mélange aux cellules fixes. Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque.
Laissez la plaque sur la glace pendant une heure. À la fin de l’incubation, répétez l’étape de lavage neuf fois avec le perm one-X et le tampon de lavage. Ajouter ensuite 25 microlitres du tampon de lavage FACS à tous les puits de la plaque.
Pipette de haut en bas à quelques reprises pour mélanger la solution. Enfin, transférer les échantillons mélangés dans des tubes de microtiter. Rechargez les tubes avec le tampon de lavage FACS à un volume total de 200 microlitres, et procéder à l’analyse de cytométrie de flux.
Après la stimulation anti-CD-3, cd-28, une augmentation de l’activation de caspase-3 et la downregulation de TCR ont été observées dans les échantillons non traités et les échantillons simulés de DMSO. En outre, une augmentation de l’expression de CD-69 a été observée dans les deux échantillons stimulés. Les échantillons traités à la dexaméthasone ont montré une augmentation de l’activation de caspase-3 indépendamment de l’upregulation de CD-69, comme prévu pour l’effet apoptosis-induisant indépendant et la stimulation de TCR.
L’affaiblissement sélectif des phénomènes d’activation de T-cellule a été montré par différents inhibiteurs qui ont supprimé l’activation de caspase-3 et le CD-69 up-regulation, ou ont empêché cd-69 up-regulation, mais n’ont pas altéré l’activation de caspase-3. Il y avait également des inhibiteurs qui n’ont pas visé une kinase pertinente de la voie tcr-signalisation, et n’ont donc pas supprimé la réglementation de CD-69 et l’activation de caspase-3. Le résultat d’écran de staurosporine, le contrôle apoptosis-positif, a montré des niveaux élevés d’activation de caspase-3, comme prévu.
Cependant, le résultat a également montré de faibles niveaux d’expression de CD-69 qui peuvent être attribués à son inhibition médiatisée de la protéine kinase C ou à son apoptose induite avant l’expression de CD-69. La comparaison des différents protocoles d’analyse n’a montré aucune différence dans la caspase-3 active, le CD-69, et la coloration de TCR du contrôle négatif, le contrôle positif pour la mort cellulaire, le contrôle de véhicule, et un échantillon inhibiteur-traité. Les stades de pré-incubation sont destinés à faciliter l’utilisation de la plaque à petit volume pour la culture des cellules.
Le protocole standard dépendant des centrifugeuses est également fourni dans le manuscrit. Des inhibiteurs ou des cibles potentiellement intéressants peuvent être validés à l’aide de différents types de cellules et aussi chez différentes espèces, telles que les lymphocytes de souris pagophéraux ou les cellules primaires humaines. La caractérisation ultérieure des molécules identifiées et des cibles peut aider à améliorer la compréhension de la biologie des cellules T et à élargir les cibles possibles pour l’immunomodulation.
