دراسة البيئة الدقيقة الورم أمر صعب بسبب تعقيده. لقد قمنا بتطوير microvirarrays البيئة الدقيقة التي تتكون من بيئات صغيرة بسيطة combinatorial التي تسمح بتحديد الدوافع الرئيسية للنمط الظاهري الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لمنصة MEMA هي أنه نظرًا لأن ظروف البيئة الدقيقة محددة جميعًا ، فمن السهل تحديد عوامل البيئة الدقيقة التي تحرك الأنماط الظاهرية من الاهتمام.
منصة MEMA قابلة للتطبيق على نطاق واسع في النظم الأخرى غير السرطانية، بما في ذلك سلالات الخلايا الأولية والخلايا الجذعية. هناك عدد من الحيل الهندسية والخطوات التي قمنا بتطويرها لتسريع العمل على مقاعد البدلاء الرطب وتبسيط البروتوكول. للبدء، استخدم طابعة دبوس اللمس لطباعة خليط طباعة المصفوفة خارج الخلية في بقع فيدوسي في لوحات ثمانية-جيدا.
استخدم دبابيس قطرها 350 ميكرومتر مرتبة في تكوين رأس طباعة أربع مرات وسبع لطباعة المصفوفة خارج الخلية للميكراتوميات البيئة الدقيقة. يتم طباعة كتلة الكولاجين على MEMAs كشبكات. توفر الآبار المملوءة بـ PBS رطوبة إضافية لمنع جفاف لوحة مصدر خليط المصفوفة الخارجية الخلية.
اطبع الصفيفات في اللوحات ذات الثمانية بئر كـ 20 عموداً بـ 35 صفاً، وذلك لما مجموعه 700 نقطة. بعد الطباعة، لوحات تخزين في مجفف لمدة لا تقل عن ثلاثة أيام قبل الاستخدام. أولاً، تصميم تخطيط لوحة 96-well مع التباعد الذي يسمح باستخدام ماصة متعددة القنوات مع أربع نصائح متباعدة، بحيث يمكن معالجة العديد من لوحات MEMA في وقت واحد.
ثم استرداد اليغاندات من الثلاجة، وذوبان الجليد في غطاء محرك تدفق لامينار. نفض الغبار لفترة وجيزة وتدور أسفل كل أنبوب. استخدم المخزن المؤقت الموصى به من قبل الشركة المصنعة لتخفيف الأربطة إلى مخزون عامل 200 مرة.
Pipette 10 ميكروليترس من كل 200 مرة الأسهم يغاند في المقابلة جيدا داخل لوحة 96 جيدا. استخدام فيلم الختم لختم لوحات وتخزينها في ناقص-20 درجة مئوية. جعل لوحات العلاج ligand على دفعات، والتقاط جميع البيانات الوصفية لتحليل المصب.
قبل الخلايا الاستزراع، حظر MEMAs مع ميليلترتين في بئر من المخزن المؤقت حظر nonfouling لمدة 20 دقيقة. استخدام Y-المقسم مع اثنين من ماصات باستور لpirate العازلة سد في آبار متعددة في وقت واحد، ومن ثم ثلاثة أضعاف غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني. لمنع جفاف، وترك حجم النهائي من برنامج تلفزيوني في الآبار حتى جاهزة لطلاء الخلية.
قبل تجربة MEMA كاملة، تحسين تركيز البذر الخلايا MCF7 عن طريق إجراء تجربة المعايرة الخلية. بقعة مثالية، كما هو مبين هنا، لديها ما يكفي من أرقام الخلايا لاستخراج البيانات، ولكن ليس الكثير أن البقعة هي التقاء مفرط. في MEMA، التعرق المتبقية PBS وبذر MCF7 الخلايا في 30، 000 إلى 35،000 الخلايا في بئر في مليلتر اثنين من البذور المتوسطة.
ضع MEMA في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد التصاق بين عشية وضحاها في الحاضنة، التعرق المتوسطة واستبدالها بمليلترين من متوسطة النمو المخفضة لعزل التأثير المحفز للليغانات المحددة. ثم ذوبان لوحة علاج ligand المجمدة سابقا على الجليد.
ذاب جهاز الطرد المركزي لوحة في 200 مرة ز لمدة دقيقة واحدة. نقل 200 ميكرولترات من المتوسط من كل بئر في لوحة الثقافة MEMA إلى البئر المناسبة في لوحة علاج الليجندة. الميette صعودا وهبوطا لخلط ليجند مع المتوسطة، ونقل هذا الخليط مرة أخرى إلى البئر المناسبة في لوحة الثقافة MEMA.
صخرة طفيفة باليد وإعادة لوحات MEMA إلى الحاضنة لثقافة مزيج ليجند-ECM في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 71 ساعة، أضف 100 مرة وحدة EdU إلى آبار MEMA لتركيز نهائي من 10 ميكرومولار. احتضانه لمدة ساعة أخرى في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة النهائية، اتعرق الآبار. قم بإصلاح MEMAs في مليلترين في بئر 2٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم الطامح PFA من الآبار.
Permeabilize مع ملليلترين في بئر من 0.1٪ السطحي غير الأيوني لمدة 15 دقيقة. التعرق السطحي، ومن ثم غسل الآبار مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني وبرنامج تلفزيوني-T، بالتسلسل. بعد ذلك، إضافة 1.5 ملليلتر من الكواشف EdU الكشف عن التفاعل إلى كل بئر.
احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، هزاز ومحمية من الضوء. ثم إخماد رد الفعل مع 1.5 ملليلتر مخزن التبريد التجاري في البئر. التعرق مرة أخرى، ويغسل مع برنامج تلفزيوني-T قبل احتضان مع تركيزات محسنة من البقع أو الأجسام المضادة.
احتضان آبار MEMA مع الأجسام المضادة الأولية في عازلة تلطيخ، هزاز في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد احتضان الأجسام المضادة الأولية، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني تليها برنامج تلفزيوني-T. إضافة الأجسام المضادة الثانوية في 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر DAPI، المخفف في عازلة تلطيخ.
احتضان، هزاز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الآبار مرتين مع ملليلتر اثنين في بئر من برنامج تلفزيوني، وتركها في المليلترين النهائي من برنامج تلفزيوني. لصورة ملطخة MEMA، وضعه على مرحلة المجهر من نظام التصوير الآلي مع قنوات الكشف الفلورسنت المناسبة.
إخراج بيانات الصورة الناتجة إلى نظام إدارة الصور. قطع الخلايا وحساب مستويات الكثافة باستخدام CellProfiler. في هذا البروتوكول، تشير ملفات تعريف دورة الخلية لقيم كثافة DAPI binned مقابل عدد الخلايا من لوحة ثمانية جيداً إلى خلايا في مرحلة G1 مقابل G2.
وهذا يتوافق مع اثنين من محتوى nDNA في الخلايا في مرحلة النمو المبكر، وأربعة محتوى nDNA في الخلايا على وشك الخضوع للتصلب. ويظهر تأثير البيئة الدقيقة لليغانندات و ECM على كل من رقم الخلية وEU التأسيس. يشير اللون الأحمر إلى ارتفاع عدد الخلايا، كما أن اللون الأزرق هو رقم الخلية الأدنى.
العديد من الآثار هي التي تحركها يغاند، كما لم تؤثر حالة ECM بقوة رقم الخلية أو الإيجابية EdU. Natagen 1 هو استثناء واضح، كما أن وجود هذا جزيء ECM يمنع ربط الخلايا ونمو MCF7. يغاندس مثل FGF6 و neuregulin-1 ألفا تعزيز عدد الخلايا ومعدلات عالية من دمج EdU، في حين أن يغاندس مثل أمفيريغولين ونيوريغولين-1 SMDF تمنع ربط الخلايا ونمو الخلايا.
مثال على خلايا MCF7 المتنامية على بقعة MEMA تعامل مع neuregulin-1 ألفا يظهر معدلات عالية من دمج EdU، المشار إليها من قبل النوى الوردي. في هذه الصورة، البقعة الخضراء هي قناع الخلية، والأزرق هو DAPI. منذ تجربة MEMA كاملة مكلفة، من المهم جداً تنفيذ خطوات التحسين، مثل خلايا ومصل المعايرة، قبل إجراء التجربة الكاملة.
مرة واحدة يتم تحديد الظروف الدقيقة البيئة من الفائدة باستخدام منصة MEMA، يمكن دراسة يغاندس محددة والبروتينات مصفوفة خارج الخلية في أكثر عمقا باستخدام التقليدية 2D و 3D نظم الخلية ثقافة.
