Tümör mikroçevresini incelemek karmaşıklığı nedeniyle zordur. Tümör hücre fenotiplerinin ana sürücülerinin belirlenmesine olanak tanıyan basit kombinatorial mikroortamlardan oluşan mikroçevre mikrodizileri geliştirdik. MEMA platformunun en büyük avantajı, mikroçevre koşullarının tümü tanımlanmış olduğundan, ilgi nin fenotiplerini yönlendiren mikroçevre faktörlerini tanımlamanın kolay olmasıdır.
MEMA platformu, primer hücre suşları ve kök hücreler de dahil olmak üzere diğer kanser dışı sistemlerde yaygın olarak uygulanabilir. Islık tezgah çağrılarını hızlandırmak ve protokolü basitleştirmek için geliştirdiğimiz bir dizi mühendislik hilesi ve adımı var. Başlamak için, hücre dışı matris baskı karışımını sekiz kuyuplakaya sabit noktalara yazdırmak için dokunmatik pimli yazıcı kullanın.
Mikroçevre mikrodizileri için hücre dışı matrisi yazdırmak için dört kez-yedi baskı kafası yapılandırmasında düzenlenmiş 350 mikrometre çapındaki pimleri kullanın. Kollajen blok bir ızgara olarak MEMA üzerine basılır. PBS dolu kuyular, hücre dışı matris baskı karışımı kaynak plakasının kurumasını önlemek için ekstra nem sağlar.
Dizileri sekiz kuyulu plakalara, toplam 700 nokta için 35 satıra 20 sütun halinde yazdırın. Baskıdan sonra, plakaları kullanmadan önce en az üç gün boyunca kurutucuda saklayın. İlk olarak, birçok MEMA plakasının tedavisinin aynı anda yapılabilmeleri için, dört aralıklı uçlu çok kanallı pipet kullanımına olanak tanıyan aralıklı 96 kuyuluk bir plaka düzeni tasarlayın.
Sonra dondurucudan ligands almak ve bir laminar akış kaputunda buz içinde çözülür. Kısaca flick ve her tüp aşağı spin. Ligandları 200 kat çalışan bir stokla seyreltmek için üreticinin tavsiye edilen tamponu kullanın.
Pipet 10 mikrolitre her 200-kez ligand stok 96-iyi plaka içinde ilgili kuyuiçine. Plakaları mühürlemek ve eksi-20 santigrat derecede saklamak için sızdırmazlık filmini kullanın. Ligand tedavi plakalarını gruplar halinde yapın ve akış aşağı analizi için tüm meta verileri yakalayın.
Hücreleri çiftlemeden önce, 20 dakika boyunca kirlenmez engelleme tampon kuyubaşına iki mililitre ile MEMA'ları engelleyin. Aynı anda birden fazla kuyuda engelleme tamponu aspire etmek için iki Pasteur pipetleri ile bir Y-splitter kullanın ve sonra pbs ile kuyuları üç kez yıkayın. Kurutmayı önlemek için, hücre kaplaması için hazır olana kadar pbs'nin son hacmini kuyularda bırakın.
Tam bir MEMA denemesiöncesinde, hücre titrasyonu deneyi yaparak MCF7 hücre tohumlama konsantrasyonu optimize edin. İdeal bir nokta, burada gösterildiği gibi, veri ayıklamak için yeterli hücre numaraları vardır, ama nokta aşırı confluent olduğunu çok değil. MEMA'da, kalan PBS ve tohum MCF7 hücrelerini 30, 000 ila 35, 000 hücreyi iki mililitrelik tohumlama ortamında alıto.
MEMA'yı 37 derecede bir kuvöze yerleştirin. Kuvözde bir gecede yapvere den sonra, orta aspire ve belirli ligandların uyarıcı etkisini izole etmek için azaltılmış büyüme ortamı iki mililitre ile değiştirin. Sonra buz üzerinde daha önce dondurulmuş ligand tedavi plakası eritin.
Santrifüj bir dakika için 200 kez g'de erimiş plaka. MEMA kültür plakasındaki her kuyudan 200 mikrolitre orta yı ligand arıtma plakasına uygun kuyuya aktarın. Pipet yukarı ve aşağı orta ile ligand karıştırmak ve mema kültür plaka uygun kuyuya bu karışımı geri aktarın.
Elle hafifçe kayan ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ligand-ECM kombinasyonu kültür için kuvöz MEMA plakaları dönmek. 71 saat sonra, 10 mikromolar son konsantrasyon için MEMA kuyuları için 100 kez EdU ekleyin. 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle bir saat daha kuluçkaya yatırın.
Son kuluçkadan sonra, kuyuları aspire edin. MM'leri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %2 PFA'nın kuyusu başına iki mililitre de düzeltin. Sonra kuyulardan PfA aspire.
15 dakika boyunca % 0.1 noniyonik yüzey aktif kuyu başına iki mililitre ile permeabilize. Sürfaktanas, ve sonra sırayla, PBS ve PBS-T iki mililitre ile kuyuları yıkayın. Bundan sonra, her kuyuya 1,5 mililitre EdU algılama reaksiyonu reaktifi ekleyin.
Oda sıcaklığında bir saat kuluçka, sallanan ve ışıktan korunmaktadır. Sonra iyi başına 1.5 mililitre ticari söndürme tampon ile reaksiyon söndürmek. Tekrar aspire edin ve en iyi şekilde boya veya antikor konsantrasyonları ile kuluçkaya yatırmadan önce PBS-T ile yıkayın.
Mema,tamponun boyanmasında birincil antikorlara sahip, bir gecede dört derece santigrat derecede sallayarak MEMA kuyularını inkübün. Primer antikor inkübasyonundan sonra kuyuları PBS ve ardından PBS-T ile yıkayın. Mililitre DAPI başına 0,5 mikrogram ikincil antikorlar ekleyin, boyama tampon seyreltilmiş.
Kuluçka, karanlıkta oda sıcaklığında bir saat sallanan. Kuyuları pbs kuyusu başına iki mililitre ile iki kez yıkayın ve pbs'nin son iki mililitresinde bırakın. Lekeli MEMA'yı görüntülemek için, uygun floresan algılama kanallarına sahip otomatik görüntüleme sisteminin mikroskop aşamasına yerleştirin.
Görüntü yönetim sistemine çıkan görüntü verilerinin çıktısı. Hücreleri segmente edin ve CellProfiler kullanarak yoğunluk düzeylerini hesaplayın. Bu protokolde, binned DAPI yoğunluk değerlerinin hücre döngüsü profilleri ile sekiz kuyulu bir plakadan alınan hücre sayıları G1 ve G2 hücre döngüsü fazındaki hücreleri gösterir.
Bu, erken büyüme evresinde hücrelerdeki iki nDNA içeriğine ve mitoz bölünmek üzere olan hücrelerdeki dört nDNA içeriğine karşılık gelir. Ligandların ve ECM'lerin mikro ortamının hem hücre numarası hem de EdU dahili olması üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Kırmızı daha yüksek hücre numarasını gösterir ve mavi daha düşük hücre numarasıdır.
Etkileri çoğu ligand odaklı, ECM durumu güçlü hücre numarası veya EdU pozitifliği etkilemedi gibi. Natagen 1 açık bir istisna, Bu ECM molekülün varlığı hücre bağlanması ve MCF7 büyümesini inhibe olarak. FGF6 ve neuregulin-1 alfa gibi ligandlar hücre sayısını artırır ve yüksek EdU birleşme oranlarına sahiptir, amphiregülin ve neuregulin-1 SMDF gibi ligandlar hücre bağlanmasını ve hücrelerin büyümesini engeller.
Neuregulin-1 alfa ile tedavi edilen bir MEMA yerinde büyüyen MCF7 hücrelerinin bir örneği, pembe çekirdekleri ile gösterilen yüksek EdU birleşme oranlarını göstermektedir. Bu resimde, yeşil leke hücre maskesi ve mavi DAPI olduğunu. Tam bir MEMA deneyi pahalı olduğundan, tam denemeyi gerçekleştirmeden önce hücre ve serum titrasyonları gibi optimizasyon adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir.
Mema platformu kullanılarak mikroçevresel koşullar tanımlandıktan sonra, spesifik ligandlar ve hücre dışı matriks proteinleri geleneksel 2D ve 3D hücre kültür sistemleri kullanılarak daha derinlemesine incelenebilir.
