التعديل ما بعد الترجمة من البروتينات من قبل ubiquitin البروتين الصغيرة تشارك في العديد من الأحداث في الخلية. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل البروتين في كل مكان. نستخدم تقنيات التخصيب وقياس الطيف الكتلي للكشف عن كل مكان.
لقد قمنا بالعديد من التحسينات على تحليل الببتيدات الديجلي التي تنشأ من البروتينات في كل مكان. وتشمل هذه تجزئة الببتيد الخام قبل التخصيب، وتطبيق إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدما في أوربيرابراب. بالإجمال ينتج هذا في تغطية كبيرة من ال فيوبيكيتينومي.
13- يصعب وصف عدة جوانب من البروتوكول بالكلمات. إن تصور بعض الخطوات الأساسية ضروري للتمكن من تكرار هذه التحليلات من قبل مشغل مختلف في مختبر مختلف. سيتم إثبات الإجراء من قبل كاريل بيزستاروستي، وهو فني كبير في مختبري.
ابدأ من خلال إعداد الخلايا المستزرعة أو أنسجة دماغ الماوس للتجربة. إذا كان العمل مع الخلايا، lyse بيليه الخلية من واحد 150 سم مربع لوحة الثقافة في مليلترين من الجليد البارد، 50 ملليمولار تريس HCL مع 0.5٪ إزالة الصوديوم. يغلي المزيج في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم سونيكات عليه في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان استخدام في أنسجة الدماغ الماوس vivo, lyse في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 ملليمولار تريس HCL, 12 ميليمولار الصوديوم ديوكسيكولات و 12 ميليمولار الصوديوم N-lauroylsarcosinate. سونيكات لlysate لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
ثم يغلي لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية. المقبل, quantitate كمية البروتين الإجمالي باستخدام كمية قياس القيمة امتصاص BCA البروتين عدة فحص البروتين, التي ينبغي أن يكون على الأقل عدة ملليغرام لdiGly الببتيد المناعي الناجح. بالنسبة لتجارب SILAC، اخلطي البروتينات الخفيفة والثقيلة المسماة بنسبة واحدة إلى نسبة واحدة بناءً على إجمالي كمية البروتين.
خفض جميع البروتينات مع خمسة 1DTT ميليمولار لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية. وبعد ذلك alkylate لهم مع iodoacetamide 10 ملليمتر لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم قم بإجراء هضم البروتين مع ليس-سي لمدة أربع ساعات.
والتبسين الهضم بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، أو في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، تقسيم العينة إلى اثنين من أنابيب Eppendorf ملليلتر وإضافة TFA إلى العينة هضم إلى تركيز نهائي من 0.5٪ الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة 10 دقائق لترسب وإزالة جميع المنظفات. جمع الببتيد الذي يحتوي على افرا لتجزئة لاحقة.
استخدام ارتفاع درجة اله عكس المرحلة C18 اللوني لكسر الببتيدات التربتيك. إعداد فارغة ستة ملليلتر خرطوشة العمود مليئة 0.5 غرام من مادة المرحلة الثابتة لحوالي 10 ملليغرام من البروتين هضم. قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد وغسله بحوالي 10 مجلدات تبلغ 0.1٪ TFA، متبوعة بـ 10 كميات من الماء.
Elute الببتيدات في ثلاثة كسور باستخدام 10 مجلدات العمود من 10 ميليمولار الامونيوم formate مع سبعة, 13.5 و 50٪ الأسيتريتريل, على التوالي. ثم، ليه جميع الكسور. دفعة واحدة من بقايا ubiquitin عزر الأجسام المضادة مترافقة إلى البروتين يتم تقسيم الطين حبة agarose إلى ستة كسور متساوية.
قم بذوبان كسور الببتيد الثلاثة وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتدور على الحطام. إضافة عظمى من الكسور الثلاثة إلى الطين حبة مع الحفاظ على الكسور الثلاثة الأخرى على الجليد. واحتضانهم لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية على وحدة دوار.
ثم، تدور أسفل الخرز. نقل المافع إلى دفعة جديدة من الخرز. وكرر الحضانة مع كسور الطين الخرز الثلاثة المتبقية.
تخزين االستفنات لتحليل البروتيوم العالمي اللاحقة. ونقل الخرز إلى 200 نصائح ماصة ميكروليت مجهزة قابس مرشح GFF. وضع النصائح في أنابيب 1.5 ملليلتر مجهزة محول تلميح الطرد المركزي وغسل الخرز ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من الجليد الباردة IAP العازلة، تليها ثلاثة يغسل مع الماء النقي الباردة الجليد.
تدور أسفل الأعمدة في 200 مرة G لمدة دقيقتين بين يغسل، مع التأكد من عدم السماح للعمود الجاف. بعد الغسيل النهائي، وpeute الببتيدات مع دورتين في 50 ميكرولترات من 0.15٪ TFA. Desalt الببتيدات مع طرف المرحلة C18 وتجفيفها مع الطرد المركزي فراغ.
تنفيذ تجارب LC-MS/MS على مطياف الكتلة الحساسة مقرونة بنظام LC تدفق نانوي. تم إعداد العمود وفقاً لتوجهات المخطوطات ويتم الاحتفاظ به عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الحيازة المعتمدة على البيانات.
جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية مع وضع هدف متحكم فيه ربح آلي من 4E5 ووقت حقن أقصى 50 مللي ثانية. إجراء تحليل لقياس الطيف الشامل في الوضع الأول الأكثر كثافة، وذلك باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالية من ثلاث ثوان. ثم تنفيذ جولة ثانية من تحليل MS DDA في الوضع الأول على الأقل مكثفة، والتي سوف تضمن الكشف الأمثل للببتيدات وفرة منخفضة.
تصفية أيونات السلائف وفقا للدول تهمة بهم وتكليف ذروة monoisotopic. واستبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقاً بشكل ديناميكي لمدة 60 ثانية. عزل السلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية الروبولي تعيين إلى عرض 1.6 طومسون.
ثم جمع أطياف MS2 في فخ أيون في السيطرة على اكتساب الآلي من 7E3 مع وقت الحقن الأقصى من 50 مللي ثانية وHCD الطاقة الاصطدام 30٪ تحليل الطيف الشامل الملفات الخام باستخدام محرك بحث مناسب، مثل جناح البرمجيات MaxQuant المتاحة مجانا على أساس محرك البحث أندروميدا. افتح MaxQuant وحدد ملفات البيانات الخام المناسبة. تعيين عدد المعالجات وانقر على علامة التبويب المعلمات المجموعة محددة.
حدد الهضم، والسماح لثلاثة انشقاقات غاب. ثم حدد التعديلات وإضافة diGly إلى التعديلات المتغير. حدد علامة التبويب المعلمات العمومية وإضافة قاعدة بيانات تسلسل البروتين الصحيح.
اترك الإعدادات الأخرى كإعدادات افتراضية واضغط على البدء لإجراء بحث قاعدة البيانات. للتحليل الكمي لملفات تجربة سيلاك، قم بتعيين التعدد إلى اثنين، وحدد تسميات الأحماض الأمينية الثقيلة. عند الانتهاء من البحث، استيراد الملفات النصية إلى Perseus.
وقد استخدم هذا البروتوكول لتحديد مواقع في كل مكان في البروتينات من الخلايا المستزرعة وفي المواد الحية عن طريق الكشف عن الببتيدات diGly مع نانو فلوس LC-MS/MS. وقد أدخلت تحسينات عديدة على البروتوكول القائم مما أدى إلى ارتفاع عدد الببتيدات التي تم اكتشافها. تم إجراء تجزئة فجة إلى ثلاثة أجزاء قبل التناعي.
واحد من الكسور يحتوي على ubiquitin الخاصة K48 تعديل الببتيد ديجلي ديجلي، والتي تتميز ذروة واسعة في الكرومومات LC. وعلاوة على ذلك، تم تعديل نظام تفتيت الببتيد للجمع بين LC-MS يعمل مع أعلى وأدنى أنظمة التفتيت الأولى في إجراء تحليل البيانات، والتي أنتجت أكثر من 4000 ببتيدات تحللية فريدة إضافية. يمكن تحديد أكثر من 23,000 ببتيدات diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa المعالجة بمثبطات بروتية.
ومن بين جميع الببتيدات التي تم تحديدها على مدى ثلاث شاشات متماثلة بيولوجية، كان هناك أكثر من 9,000 في كل ثلاث شاشات، في حين كان هناك أكثر من 17,000 في اثنين على الأقل من ثلاثة تكرارات. عدد من تحديد الببتيد يتوقف إلى حد كبير على كمية المواد المدخلة. ويمكن توقع عدد تقريبي من الببتيدات diGly المحددة اعتمادا على المواد الأولية، ولكن هذه الأرقام هي فقط تقديرات، وسوف تعتمد أيضا على نوع من مطياف الكتلة المستخدمة.
عند تنفيذ هذا البروتوكول ، والخبرة السابقة مع الطيف الشامل أساليب البروتيوميات القائمة والتعامل مع وتحليل كميات عينة دقيقة سيكون من المفيد بالتأكيد. ويمكن استبدال برنامج MaxQuant بأي خوارزمية أخرى للبحث في قواعد البيانات. ويمكن أيضا أن تستخدم نوع مختلف من مطياف الشامل.
قد تختلف النتائج من حيث تحديد الببتيد قليلاً، ولكن هذا هو نموذجي لأي قياس الطيفي الشامل القائم على البروتيوميكس. Ubiquitin مهم في التقدم لتدهور البروتين بوساطة، ولكن أيضا يلعب دورا في العديد من العمليات الأخرى في الخلية. معرفة أعمق من ubiquitin باعتبارها تعديل ما بعد الترجمة أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها بشكل أفضل.
