سرطانات منطقة الرأس والرقبة أصبحت منتشرة بشكل متزايد. ومع ذلك، هناك فهم محدود للورم microenonment وآليات مقاومة العلاج في هذه المنطقة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتكبيل البيئة الأصلية الدقيقة لأورام الرأس / الرقبة بطريقة يمكن الوصول إليها وتنتج مظاهر سريرية مماثلة لتلك التي ينظر إليها في البشر.
عندما وصلت ثقافة الخلايا السرطانية 70٪ التقاء، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة في غسل وإرفاق الخلايا مع ما يكفي من 0.25٪ التربسين لتغطية السطح السفلي من قارورة الثقافة. بعد ثلاث إلى أربع دقائق في حاضنة ثقافة الخلية، تأكيد مفرزة تحت المجهر الخفيف وتحييد التربسين مع 12 ملليلتر من متوسطة DMEM F12، تستكمل مع مصل الأبقار الجنين. نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وخلط الخلايا ثلاث إلى أربع مرات عن طريق عكس.
ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في الدم و DMEM خالية من المضادات الحيوية في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السرطانية السادسة لكل 50 ميكرولترات من تركيز متوسط على الجليد. مباشرة قبل الحقن، وخلط الخلايا في واحد إلى واحد الخلايا السرطانية تعليق إلى الطابق السفلي نسبة مصفوفة الغشاء على الجليد. تحميل حقنة واحدة 0.5 ملليلتر مجهزة بإبرة 23 قياس مع 100 ميكرولتر من الخلايا لكل المتلقي.
وضع الحقن على الجليد وتأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في الماوس تخدير. بعد ذلك، أدخل الإبرة في منطقة البوكفال اليمنى أو اليسرى من خلال المساحة المفتوحة المتاحة على جانبي الفم مع الحفاظ على الحقنة بالتوازي مع منطقة البوكتال بينما هي داخل تجويف الفم لتسهيل حقن حجم 100 ميكرولتر الكامل من تعليق مصفوفة غشاء الخلية على مدى فترة خمس ثوان. الحفاظ على الحقنة في مكانها لمدة خمس ثوان إضافية لضمان أن جميع المواد قد تم حقنها قبل سحب الحقنة بلطف.
سوف تصبح الأورام واضحة بشكل كبير في غضون أسبوع. بعد أسبوع واحد من الحقن، استخدم الفرجر لقياس طول وعرض كل ورم لتحديد حجم الورم مرة أو مرتين في الأسبوع. و قياس وزن كل لتقييم آثار نمو الورم على التغذية.
عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم مقصًا حادًا وملقطًا حادًا لإجراء شق جلدي عبر خط الوسط في الرقبة. وإدراج مقص بلطف تحت الجلد تغطي الورم لخلق جيوب الهواء عن طريق دفع المقص عبر وإلى الجلد. مرة واحدة يتم فصل الجلد بما فيه الكفاية من الورم، مكوس الغدد الليمفاوية استنزاف لتجنب وجود أنسجة الورم الخلط بسبب وجود الأنسجة الليمفاوية وقطع من خلال حدود الورم حتى يتم فصل حجم كامل.
لمعالجة الورم لتحليل المصب، وقطع الورم إلى قطعة ملليمتر واحد إلى اثنين من الحجم ووضع القطع في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على كولاجيناز ثلاثة، DNAs واحد، ومثبط التربسين. بعد احتضان قطع الورم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، مع اهتزاز كل 10 دقائق، إضافة 20 ملليلتر من HBSS إلى الأنبوب وتمرير تعليق تحتوي على قطع الورم من خلال 70 ميكرومتر صب مصفاة النايلون. استخدام خمسة مللي المكبس حقنة الهريس قطع الورم في مصفاة وإضافة 10 ملليلتر إضافية من HBSS من خلال مصفاة.
تدور أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في 2-3 ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة مع الأنابيب صارمة، تحييد تحلل مع 20 ملليلتر من HBSS جديدة بعد دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ثم إعادة تعليق الخلايا في 20 ملليلتر إضافية من HBSS للطرد المركزي آخر والضغط على الخلايا من خلال مرشح صب 40 ميكرومتر لإزالة أي حطام النهائي من تعليق الخلايا السرطانية.
تنمو أورام LY2 بمعدل أعلى، مقارنة بأورام B4B8. والفئران التي تظهر إزاحة الفك تتطور بسرعة فقدان الوزن، وذلك بسبب عسر البلع. متوسط البقاء على قيد الحياة في الفئران LY2 هو أيضا أقل من نصف التي لوحظت للفئران الحاملة للورم B4B8.
يُظهر التصوير بالرنين المغناطيسي للفئران الحاملة للورم أورامًا مرسومة بشكل جيد تمتد إلى الطبقة الداخلية من الغشاء المخاطي للزُوَق، ولكن ليس إلى اللسان أو الأجهزة المجاورة الأخرى. يشير الفحص الهدولوجي إلى أن جميع الفئران الحاملة للورم LY2 تتطور سرطان الخلايا الحرشفية المتمايزة بشكل سيئ ، في حين أن الفئران التي تحمل أورام B4B8 تطور سرطان الخلايا الحرشفية المتمايزة بشكل معتدل. جميع الفئران التي تحمل ورم LY2 أيضا قد أكد نخر انقباضية، مع الغالبية تظهر النخر المعتدل إلى الشديد.
في هذه التجربة التمثيلية، تم حصاد ورم LY2 ومعالجته بعد ثلاثة أسابيع من حقن الخلايا السرطانية في منطقة البوكسال، كما هو موضح. تمثل الخلايا المناعية إيجابية CD45 7.3٪ من مجموع السكان الخلايا السرطانية. الخلايا النخاعية إيجابية CD11b تمثل 37.8٪ من جميع الخلايا إيجابية CD45, وقد تم تحديد معظمها لتكون الضامة إيجابية F480, مع مجموعات صغيرة من العدلات والخلايا القامع النخاعي المشتقة لوحظ أيضا.
الخلايا التائية تتألف من 15.9٪ من الخلايا المناعية CD45 إيجابية السكان, 53.4٪ منها كانت CD4 إيجابية FoxP3-إيجابية الخلايا T التنظيمية. الخلايا القاتلة الطبيعية تتألف من أقل من 2٪ من جميع الخلايا إيجابية CD45. من المهم ممارسة الحقن من أجل تطوير الثقة والراحة في عقد الإبرة والفأر المتلقي وفي تعريض فم الحيوان.
بمجرد إجراء العملية بنجاح، يمكن إجراء تجارب تتضمن تقييم استجابة الورم للعلاج أو تقييم العوامل الكامنة والصغرى في البيئة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق في تصميم تجربة سريرية بدأها المحقق، وتقييم آثار الجمع بين العلاج الإشعاعي مع العلاج المضاد لـ PL1 في مرضى سرطان الرأس والرقبة.
