Baş ve boyun bölgesindeki kanserler giderek yaygınlaşmaktadır. Ancak, tümör mikroçevre ve bu bölgede tedavi direnci mekanizmaları sınırlı bir anlayış var. Bu teknik, baş/boyun tümörlerinin doğal mikro çevresini erişilebilir bir şekilde özetlemek için kullanılabilir ve insanlarda görülenlere benzer klinik bulgular üretir.
Tümör hücre kültürü %70 birleştiğinde, hücreleri yıkama başına soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri kültür şişesinin alt yüzeyini kaplayacak kadar %0,25 tripsin ile takın. Hücre kültürü kuluçka makinesinde 3-4 dakika kaldıktan sonra, hafif bir mikroskop altında müfrezeyi doğrulayın ve fetal sığır serumu ile desteklenen 12 mililitre DMEM F12 ortamı ile tripsini etkisiz hale getirin. Hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik konik bir tüp aktarın ve hücreleri ters çevirerek 3-4 kez karıştırın.
Daha sonra hücreleri santrifüj ile toplayın ve serum ve antibiyotiksiz DMEM'deki peleti bir kere 10 ila buz üzerinde orta konsantrasyonda 50 mikrolitre başına altıncı tümör hücrelerine yeniden askıya alın. Enjeksiyondan hemen önce, hücreleri bire bir tümör hücrelerinin süspansiyonundaki hücreleri buz üzerinde bazal membran matris oranına karıştırın. Alıcı hayvan başına 100 mikrolitre hücre içeren 23 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir 0,5 mililitrelik şırınga yükleyin.
Şırıngaları buza yerleştirin ve anestezili bir farede parmak kıskacına yanıt verme eksikliğini onaylayın. Daha sonra, beş saniye boyunca hücre bodrum membran matris süspansiyon unun tam 100 mikrolitre hacminin enjeksiyonu kolaylaştırmak için ağız boşluğu içinde iken buccal bölgeye paralel şırınga tutarak ağzın her iki tarafında mevcut açık alan üzerinden sağ veya sol buccal bölgeye iğne takın. Şırıngayı nazikçe çekmeden önce tüm malzemenin enjekte edildiğinden emin olmak için şırıngayı beş saniye daha yerinde tutun.
Tümörler yaklaşık bir hafta içinde büyük ölçüde görünür hale gelecek. Enjeksiyondan bir hafta sonra, tümör hacmini haftada bir ila iki kez belirlemek için her tümörün uzunluk ve genişliğini ölçmek için kaliper kullanın. Ve beslenme üzerinde tümör büyüme etkilerini değerlendirmek için her hayvanın ağırlığını ölçmek.
Uygun deneysel uç noktada, boyun orta hattı ile bir deri kesi yapmak için keskin makas ve künt çakışma kullanın. Ve makası yavaşça tümörü kaplayan derinin altına takın ve makası cilde doğru iterek hava cepleri oluşturun. Deri tümörden yeterince ayrıldıktan sonra, lenf dokusunun varlığı yla tümör dokusunun şaşkına kopmasını önlemek ve tüm hacim kopana kadar tümörün sınırlarından kesilmemek için drenaj lenf düğümlerini boşaltın.
Downstream analizi için tümör işlemek için, bir ila iki milimetre büyüklüğünde parçalar halinde tümör kesmek ve kollajenaz üç içeren 50 mililitrelik konik tüp içine parçaları yerleştirin, BOS bir, ve tripsin inhibitörü. 30 dakika boyunca 37 santigrat derece tümör parçaları kuluçka sonra, her 10 dakikada bir sallayarak, tüp için HBSS 20 mililitre ekleyin ve 70 mikrometre pour naylon süzgeç ile tümör parçaları içeren süspansiyon geçmek. Süzgeçteki tümör parçalarını püre haline getirmek ve süzgeç ten 10 mililitre HBSS eklemek için beş mililitrelik şırınga pistonu kullanın.
Santrifüj ile hücreleri aşağı çevirin. 2-3 mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponundaki peleti sıkı pipetleme ile yeniden askıya alın, oda sıcaklığında iki dakika sonra 20 mililitre taze HBSS ile lysis nötralize. Sonra başka bir santrifüj için HBSS ek bir 20 mililitre hücreleri yeniden askıya ve tümör hücresi süspansiyon herhangi bir son enkaz kaldırmak için 40 mikrometre dökmefiltresi ile hücreleri zorlanma.
LY2 tümörleri B4B8 tümörlerine göre daha yüksek oranda büyür. Ve çene deplasmanı sergileyen fareler de disfaji nedeniyle hızla kilo kaybı gelişir. LY2 farelerinde ortanca sağkalım da B4B8 tümör taşıyan farelerde gözlenenin yarısından daha azdır.
Tümör taşıyan farelerin manyetik rezonans görüntülemesi, bukkal mukozanın iç tabakasına kadar uzanan, ancak dil veya diğer yakın organlara kadar uzanan iyi çizilmiş tümörleri gösterir. Histolojik inceleme, tüm LY2 tümör taşıyan farelerde kötü diferansiye skuamöz hücreli karsinom, B4B8 tümörü taşıyan farelerde ise orta derecede diferansiye skuamöz hücreli karsinom geliştiğini göstermektedir. Ly2 tümör taşıyan tüm farelerde histolojik olarak doğrulanmış nekroz vardır ve çoğunluğu orta ve şiddetli nekroz gösterir.
Bu temsili deneyde, bukkal bölge tümör hücre enjeksiyonundan üç hafta sonra LY2 tümörü hasat edildi ve işlendi. CD45-pozitif bağışıklık hücreleri toplam tümör hücre nüfusunun %7.3'ünü temsil etti. CD11b-pozitif miyeloid hücreler CD45-pozitif hücrelerin tümünün %37.8'ini temsil eder, bunların çoğu F480-pozitif makrofajlar olarak belirlenmiştir, küçük nötrofil popülasyonları ve miyeloit kaynaklı baskılayıcı hücreler de gözlenmiştir.
T hücreleri CD45-pozitif bağışıklık hücre popülasyonunun %15.9'undan, %53.4'ü CD4-pozitif FoxP3-pozitif düzenleyici T hücreleriydi. Doğal öldürücü hücreler tüm CD45-pozitif hücrelerin %2'sinden daha azını oluşturuyor. İğneyi ve alıcı fareyi tutarak ve hayvanın ağzını ortaya çıkarmak için güven ve konfor geliştirmek için enjeksiyon uyguluyorolmak önemlidir.
İşlem başarıyla yapıldıktan sonra, tümör tedavisine verilen yanıtın değerlendirilmesi veya tümörün içsel ve mikroçevresel faktörlerin değerlendirilmesini içeren deneyler yapılabilir. Bu teknik, baş ve boyun kanseri hastalarında anti-PL1 tedavisi ile radyoterapi birleştirerek etkilerini değerlendiren, bir araştırmacı tarafından başlatılan klinik çalışma tasarımında yol açmıştır.
