Os cânceres da região da cabeça e pescoço estão se tornando cada vez mais prevalentes. No entanto, há uma compreensão limitada do microambiente tumoral e dos mecanismos de resistência ao tratamento nesta região. Esta técnica pode ser usada para recapitular o microambiente nativo de tumores de cabeça/pescoço de forma acessível e produz manifestações clínicas semelhantes às vistas em humanos.
Quando a cultura das células tumorais atingir 70% de confluência, lave as células três vezes com PBS frio por lavagem e conecte as células com 0,25% de trippsina suficiente para cobrir a superfície inferior do frasco de cultura. Após três a quatro minutos na incubadora de cultura celular, confirme o desprendimento sob um microscópio leve e neutralize a trippsina com 12 mililitros de meio DMEM F12, suplementado com soro bovino fetal. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e misture as células três a quatro vezes por inversão.
Em seguida, colete as células por centrifugação e suspenda novamente a pelota em DMEM sem soro e antibióticos em uma única vez 10 a sexta células tumorais por 50 microliters de concentração média no gelo. Imediatamente antes da injeção, misture as células em uma suspensão de células tumorais de um a um com a relação de matriz de membrana no gelo. Carregue uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 23 com 100 microliters de células por animal receptor.
Coloque as seringas no gelo e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato anestesiado. Em seguida, insira a agulha na região bucal direita ou esquerda através do espaço aberto disponível em ambos os lados da boca mantendo a seringa paralela à região bucal enquanto ela está dentro da cavidade oral para facilitar a injeção do volume total de 100 microliter da suspensão da matriz da membrana do porão celular durante um período de cinco segundos. Mantenha a seringa no lugar por mais cinco segundos para garantir que todo o material tenha sido injetado antes de retirar a seringa suavemente.
Os tumores se tornarão grosseiramente visíveis em cerca de uma semana. Uma semana após a injeção, use pinças para medir o comprimento e largura de cada tumor para determinar o volume do tumor de uma a duas vezes por semana. E medir o peso de cada animal para avaliar os efeitos do crescimento do tumor na alimentação.
No ponto final experimental apropriado, use tesouras afiadas e fórceps contundentes para fazer uma incisão da pele através da linha média no pescoço. E insira a tesoura suavemente sob a pele cobrindo o tumor para criar bolsões de ar empurrando a tesoura através e para dentro da pele. Uma vez que a pele esteja suficientemente afastada do tumor, extiride os linfonodos drenantes para evitar que o tecido tumoral seja confundido pela presença de tecido linfático e corte as bordas do tumor até que todo o volume seja desconectado.
Para processar o tumor para análise a jusante, corte o tumor em pedaços de tamanho de um a dois milímetros e coloque os pedaços em um tubo cônico de 50 mililitros contendo colagenase três, DNAs um e inibidor de trippsina. Depois de incubar as peças tumorais a 37 graus Celsius por 30 minutos, com agitação a cada 10 minutos, adicione 20 mililitros de HBSS ao tubo e passe a suspensão contendo as peças tumorais através de um filtro de nylon de 70 micrômetros. Use um êmbolo de seringa de cinco mililitros para amassar as peças tumorais no coador e adicionar mais 10 mililitros de HBSS através do coador.
Gire as células por centrifugação. Suspenda a pelota em dois a três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos com tubulação rigorosa, neutralizando a lise com 20 mililitros de HBSS frescos após dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente as células em um adicional de 20 mililitros de HBSS para outra centrifugação e coe as células através de um filtro de derramamento de 40 micrômetros para remover quaisquer detritos finais da suspensão da célula tumoral.
Os tumores LY2 crescem em uma taxa maior, em comparação com os tumores B4B8. E camundongos que exibem deslocamento da mandíbula rapidamente desenvolvem perda de peso, devido à disfagia. A sobrevida mediana em camundongos LY2 também é menos da metade do observado para camundongos portadores de tumor B4B8.
A ressonância magnética de camundongos portadores de tumores mostra tumores bem demarcados que se estendem até a camada interna da mucosa bucal, mas não na língua ou em outros órgãos próximos. O exame histológico indica que todos os camundongos portadores de tumor LY2 desenvolvem carcinoma de células escamosas pouco diferenciados, enquanto os camundongos com tumores B4B8 desenvolvem carcinoma celular escamoso moderadamente diferenciado. Todos os camundongos portadores de tumor LY2 também têm necrose histologicamente confirmada, com a maioria demonstrando necrose moderada a grave.
Neste experimento representativo, um tumor LY2 foi colhido e processado três semanas após a injeção de células tumorais da região bucal, como demonstrado. As células imunes cd45 positivas representaram 7,3% da população total de células tumorais. As células mielóides mielóides positivos do CD11b representaram 37,8% de todas as células CD45 positivas, a maioria das quais foram determinadas como macrófagos f480 positivos, com pequenas populações de neutrófilos e células supressoras derivadas de mielóide também observadas.
As células T constituíam 15,9% da população de células imunes CD45 positivas, das quais 53,4% eram células T reguladoras de CD4 positivos FoxP3. As células assassinas naturais compunham menos de 2% de todas as células CD45 positivas. É importante praticar a injeção para desenvolver confiança e conforto na retenção da agulha e do rato receptor e na exposição da boca do animal.
Uma vez realizado o procedimento, experimentos envolvendo a avaliação da resposta tumoral à terapia ou avaliação dos fatores intrínsecos e microambientais do tumor podem ser realizados. Esta técnica abriu caminho na concepção de um ensaio clínico iniciado por pesquisadores, avaliando os efeitos da combinação da radioterapia com a terapia anti-PL1 em pacientes com câncer de cabeça e pescoço.
