استخدام الانزيمات كمحفزات في ردود الفعل يمكن أن تقلل من كمية الطاقة اللازمة للتفاعل، والحد من المنتجات الثانوية السامة. ومع ذلك، فإن استخدام الإنزيمات في الصناعة محدود، لأن الإنزيمات ليست مستقرة ويمكن أن تكون مكلفة. يمكن أن يقلل هذا البروتوكول من مقدار الوقت الذي يستغرقه تحديد ما إذا كانت الظروف ضارة بنشاط الإنزيم ، أو إذا زادت التعديلات على الإنزيم من استقراره.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يتطلب ساعات أقل من الرجل من المقايسات التقليدية الاستقرار الانزيم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع مجموعة واسعة من الإنزيمات لأنه يمكن استخدامه مع أي رد فعل يطلق أو يمتص الحرارة. لتبدأ، وإعداد 0.1 الضرس الصوديوم خلات العازلة.
قياس 800 ملليلتر من الماء المقطر في 1،000 ملليمتر تخرج من القار. ثم، تزن 8.2 غراما من خلات الصوديوم اللامائية، وإضافته إلى القارص. ضع القارق على طبق ضجة.
وضع قضيب ضجة في beaker، وبدوره على لوحة ضجة لتحريكه حتى حل تماما. عندما يتم حل خلات الصوديوم اللامائية تماما، استخدم مقياس الأسي معايرة لقياس الأسي للذوبان. استخدمي ماصة لإضافة حمض هيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم 1 من المولار تبعاً لذلك للحصول على الرقم الـ 4.6 المطلوب.
إضافة الماء المقطر في القارض حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 1000 ملليلتر. لإعداد محلول الإنزيم ، في أسطوانة تخرجت من 15 ملليلتر ، قم بقياس 8 ملليلترات من مخزن خلات الصوديوم 0.1 الضرس. ثم، إضافة محلول العازلة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع انزيم، ويهز بقوة حتى الانزيم قد حل.
إضافة حل أكثر المخزن المؤقت حتى وحدة التخزين الإجمالية تصل إلى 10 ملليلتر. تخزين محلول انزيم في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. لإعداد محلول الركيزة ، وزن الركيزة ، ووضعها في كوب زجاجي 100 ملليلتر.
استخدام اسطوانة متدرجة لقياس 20 ملليلتر من الحل العازلة، ومن ثم إضافته إلى كوب الزجاج. ضع القارق على لوحة ضجة، ووضع قضيب حركية مغناطيسية في القارب. بدوره على الحرارة، وضبط سرعة التحريك وفقا لذلك.
السماح للتحريك أن تستمر حتى تم حل الركيزة. صب محلول الركيزة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، وإضافة العازلة خلات الصوديوم أعدت سابقا، حتى حجم إجمالي 45 ملليلتر. يهز أنبوب لخلط.
تخزين الحل الركيزة في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. على الكمبيوتر، افتح ITC تشغيل وانقر فوق الإعداد. انقر فوق معدل التحريك، وتعيين إلى 350 دورة في الدقيقة.
تحقق من حجم الحقنة في 50 ميكرولتر. تعيين درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية، واضغط على التحديث. انتظر لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل المتابعة، لإتاحة الوقت الكافي لأداة مركز هتك للتسخين أو التهدئة حسب الحاجة.
قبل تحميل الإنزيم، تأكد من أن الخلية المرجعية محملة بـ 350 ميكرولترات من الماء المقطر. لتنظيف خلية العينة، تعبئة حقنة التحميل مع 500 ميكرولترات من 2 في المئة محلول التنظيف. أدخل الإبرة بعناية في خلية العينة، وملء الخلية، وإزالة السائل ببطء باستخدام نفس الحقنة.
تخلص من السائل في القارص. كرر هذه الخطوة مرتين مع 2 في المئة محلول التنظيف، ثلاث مرات مع 70 في المئة الإيثانول، ثم غسل عشر مرات مع الماء المقطر. بعد تنظيف خلية العينة، تعبئة حقنة التحميل مع 450 ميكرولترات من محلول انزيم.
إدراج الإبرة بعناية على طول الطريق إلى الجزء السفلي من الخلية عينة، واضغط ببطء المكبس وصولا الى خط ميكرولتر 100 لمنع تشكيل فقاعات الهواء. ثم، غسل حقنة المعايرة الدقيقة 50 مع الماء المقطر ثلاث مرات عن طريق وضع طرف إبرة في الماء لأخذ المياه ببطء في الحقنة، ثم الاستغناء عن المياه في حاوية النفايات. شطف مع محلول الركيزة ثلاث مرات لإزالة المياه المتبقية.
بعد ذلك، ملء حقنة المعايرة مع محلول الركيزة عن طريق رسم الحل حتى حقنة كاملة دون أي فقاعات الهواء. مع حقنة لا يزال في محلول الركيزة، وإزالة المكبس، والسماح تقريبا 2 ميكرولترات من الهواء لدخول الجزء العلوي من الحقنة، وإعادة إدراج المكبس. قم بإزالة مقبض burette من مركز المعلومات الدولي ، وضع الحقنة داخل مقبض burette ، والبرغي حتى ضيق.
امسح طرف حقنة المعايرة بالأنسجة الخالية من الوبر، ثم ضع مقبض البوريت بعناية في أداة مركز المعلومات وغلقه في مكانه. لإعداد التجربة، حدد المعايرة التزايدية. انقر فوق إدراج لإعداد الحقن.
ضبط الفاصل الزمني للحقن إلى 5, 400 ثانية, حجم الحقن إلى 4 ميكرولترات, وعدد من الحقن إلى أربعة. اضغط على "موافق" لتأكيد الإعدادات. في مربع التوازن، حدد توازن تلقائي وحرارة كبيرة متوقعة.
تعيين الأساس الأولي إلى 300 ثانية. لبدء تشغيل، انقر فوق رمز البدء بجوار معدل التحريك، ثم انقر فوق بدء، الذي يقع بجوار رمز وجع. حفظ الملف، والسماح لتشغيل الصك.
لتحليل البيانات، افتح الملف في Nano Analyze. انقر فوق البيانات، وحدد أعمدة البيانات. حدد كافة البيانات، نسخ ثم قم بلصق البيانات في Microsoft Excel.
اضبط 0 أساس بإضافة القيمة المطلوبة في 300 ثانية لجعله 0. تطبيق هذا التصحيح على العمود بأكمله من قيم معدل الحرارة. ثم رسم الرسوم البيانية من القيم الدنيا أو القصوى مقابل الوقت الذي حدثت فيه القيمة أثناء المعايرة.
في هذا البروتوكول، تظهر آثار بيانات مركز التجارة الدولية لنشاط اللاكتيز مع أربع حقن متتابعة من اللاكتوز في محلول لاكتيز في درجة حرارة 4.6 درجة مئوية عند 55 درجة مئوية، 45 درجة مئوية، 35 درجة مئوية، و 25 درجة مئوية. تم إجراء أي سيطرة على الإنزيم في 55 درجة مئوية لحرارة الاختلاط. لكل حقنة إنزيم، هناك حرارة طاردة للحرارة الأولية من الاختلاط، وبعد ذلك، التحلل التحلل الزهيد الزائد من اللاكتوز يحدث حتى يتم الانتهاء من التفاعل، ومعدل الحرارة يعود إلى خط الأساس.
الحد الأدنى للذروة الإندثرمية بعد كل حقنة، أقل قليلاً من الحقنة السابقة بسبب انخفاض النشاط الأنزيمي. كما هو متوقع، وانخفاض استقرار الانزيم لكل حقن مع زيادة درجة الحرارة. تظهر تجربة التحكم أن نشاط اللاكتاز عند 25 درجة مئوية انخفض بنسبة 8 في المائة في نشاط الإنزيم ، بسبب التخفيف بعد أربع حقن.
النظر في الحقن الرابع يظهر انخفاضا بنسبة 73 في المئة في الفحص, الفقدان الفعلي لنشاط انزيم وبالتالي كان 65 في المئة. وهكذا، فإن تخفيف اللاكتاز الناتج عن كل حقنة، كان له تأثير صغير نسبياً بنسبة 11 في المائة على نشاط الإنزيم. من المهم أن يتم مطابقة المخزن المؤقت المستخدم لصنع حلول الإنزيم والركيزة بأكبر قدر ممكن.
عدم تطابق درجة الحرارة أو التركيز يمكن أن يؤدي إلى حرارة أكبر من الاختلاط الذي يمكن أن يخفي حرارة رد الفعل. يمكنك تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الانزيمات وتحديد استقرارها من خلال قياس معدل الحرارة المنبعثة أو الممتصة أثناء التفاعل.
