El uso de enzimas como catalizadores en las reacciones puede reducir la cantidad de energía necesaria para la reacción y reducir los subproductos tóxicos. Sin embargo, el uso de enzimas en la industria es limitado, porque las enzimas no son estables y pueden ser costosas. Este protocolo podría reducir la cantidad de tiempo que se tarda en determinar si las condiciones son perjudiciales para la actividad enzimática, o si las modificaciones a la enzima han aumentado su estabilidad.
La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos horas de hombre que los ensayos tradicionales de estabilidad enzimática. Además, este protocolo se puede utilizar con una amplia gama de enzimas porque se puede utilizar con cualquier reacción que libere o absorba el calor. Para comenzar, prepare 0.1 tampón de acetato de sodio molar.
Mida 800 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados graduado de 1.000 mililitros. Luego, pesa 8,2 gramos de acetato de sodio anhidro, y agréguelo al vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un plato de agitación.
Coloque una varilla de agitación en el vaso de precipitados y encienda la placa de agitación para agitar hasta que se disuelva por completo. Cuando el acetato de sodio anhidro esté completamente disuelto, utilice un medidor de pH calibrado para medir el pH de la solución. Utilice una pipeta para añadir 1 molar de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio en consecuencia para obtener el pH deseado a 4.6.
Agregue agua destilada en el vaso de precipitados hasta que el volumen total alcance los 1.000 mililitros. Para preparar la solución enzimática, en un cilindro graduado de 15 mililitros, mida 8 mililitros del tampón de acetato de sodio molar 0.1. A continuación, agregue la solución tampón en un tubo cónico de 15 mililitros con enzima, y agite vigorosamente hasta que la enzima se haya disuelto.
Agregue más solución de búfer hasta que el volumen total alcance los 10 mililitros. Conservar la solución enzimática a 4 grados centígrados hasta su uso. Para preparar la solución de sustrato, pesar el sustrato, y colocarlo en un vaso de vidrio de 100 mililitros.
Utilice un cilindro graduado para medir 20 mililitros de la solución tampón y, a continuación, agréguelo al vaso de precipitados de vidrio. Coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación y coloque una varilla de agitación magnética en el vaso de precipitados. Encienda el fuego y ajuste la velocidad de agitación en consecuencia.
Deje que la agitación continúe hasta que el sustrato se haya disuelto. Vierta la solución de sustrato en un tubo cónico de 15 mililitros y agregue el tampón de acetato de sodio previamente preparado, hasta que el volumen total sea de 45 mililitros. Agitar el tubo para mezclar.
Conservar la solución del sustrato a temperatura ambiente hasta su uso. En el equipo, abra Ejecución de ITC y haga clic en Configuración. Haga clic en la velocidad de agitación y ajuste a 350 rpm.
Compruebe que el tamaño de la jeringa es de 50 microlitros. Ajuste la temperatura a 55 grados centígrados y pulse Actualizar. Espere al menos una hora antes de continuar, para dar tiempo suficiente para que el instrumento ITC se caliente o se enfríe según sea necesario.
Antes de cargar la enzima, asegúrese de que la célula de referencia esté cargada con 350 microlitros de agua destilada. Para limpiar la celda de muestra, llene la jeringa de carga con 500 microlitros de 2 por ciento de solución de limpieza. Inserte cuidadosamente la aguja en la celda de la muestra, llene la célula y retire lentamente el líquido con la misma jeringa.
Deseche el líquido en un vaso de precipitados. Repita este paso dos veces con una solución de limpieza del 2 por ciento, tres veces con 70 por ciento de etanol, y luego lave diez veces con agua destilada. Una vez limpiada la célula de la muestra, llene la jeringa de carga con 450 microlitros de solución enzimática.
Inserte cuidadosamente la aguja hasta la parte inferior de la celda de la muestra y presione lentamente el émbolo hasta la línea de 100 microlitros para evitar la formación de burbujas de aire. A continuación, lave la jeringa de valoración de 50 microlitros con agua destilada tres veces colocando la punta de la aguja en el agua para recoger lentamente el agua en la jeringa y, a continuación, dispensar el agua en un recipiente de desecho. Enjuague con la solución de sustrato tres veces para eliminar el agua residual.
Después de eso, llene la jeringa de valoración con solución de sustrato extrayendo la solución hasta que la jeringa esté llena sin burbujas de aire. Con la jeringa todavía en la solución de sustrato, retire el émbolo y permita que aproximadamente 2 microlitros de aire entren en la parte superior de la jeringa, y vuelva a insertar el émbolo. Retire la manija de la bureta del ITC, coloque la jeringa dentro de la manija de la bureta y atornille hasta que esté bien.
Limpie la punta de la jeringa de valoración con un tejido libre de pelusas y, a continuación, coloque cuidadosamente el mango de la bureta en el instrumento ITC y ciérralo en su lugar. Para la configuración del experimento, seleccione la valoración incremental. Haga clic en insertar para configurar las inyecciones.
Ajuste el intervalo de inyección a 5.400 segundos, el volumen de inyección a 4 microlitros y el número de inyecciones a cuatro. Pulse OK para confirmar la configuración. En el cuadro de equilibrio, seleccione auto equilibrado y grandes calores esperados.
Establezca la línea base inicial en 300 segundos. Para iniciar la ejecución, haga clic en el símbolo de inicio situado junto a la tasa de agitación y, a continuación, haga clic en Inicio, que se encuentra junto al símbolo de llave inglesa. Guarde el archivo y permita que el instrumento se ejecute.
Para analizar datos, abra el archivo en Nano Analyze. Haga clic en datos y seleccione columnas de datos. Seleccione todos los datos, copie y pegue los datos en Microsoft Excel.
Ajuste 0 línea base agregando el valor requerido en 300 segundos para que sea 0. Aplique esta corrección a toda la columna de valores de tasa de calor. A continuación, trazar gráficos de los valores mínimo o máximo con respecto al momento en que se produjo el valor durante la valoración.
En este protocolo, los rastros de datos ITC de la actividad de lactasa se muestran con cuatro inyecciones secuenciales de lactosa en una solución de lactasa en un tampón de pH 4.6 a 55 grados centígrados, 45 grados centígrados, 35 grados centígrados y 25 grados centígrados. Se realizó un control sin enzimas a 55 grados centígrados para el calor de la mezcla. Para cada inyección de enzima, hay un calor exotérmico inicial de mezcla, y posteriormente, la hidrólisis endotérmica catalizada de lactasa de lactosa se produce hasta que se completa la reacción, y la tasa de calor vuelve a la línea de base.
El mínimo pico endotérmico después de cada inyección, es un poco menor que la inyección anterior debido a la disminución de la actividad enzimática. Como era de esperar, la estabilidad enzimática para cada inyección disminuye con el aumento de la temperatura. El experimento de control muestra que la actividad de lactasa a 25 grados celsius tuvo una disminución del 8 por ciento en la actividad enzimática, debido a la dilución después de cuatro inyecciones.
Teniendo en cuenta que la cuarta inyección muestra una disminución del 73 por ciento en el ensayo, la pérdida real de actividad enzimática fue por lo tanto del 65 por ciento. Por lo tanto, la dilución de la lactasa resultó de cada inyección, tuvo un efecto relativamente pequeño de 11 por ciento en la actividad enzimática. Es importante que el tampón utilizado para hacer las soluciones de enzimas y sustratos se empate lo más cerca posible.
La falta de pH o concentración puede resultar en un mayor calor de mezcla que puede enmascarar el calor de reacción. Puede aplicar este protocolo para estudiar las enzimas y determinar su estabilidad midiendo la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción.
