L'uso di enzimi come catalizzatori nelle reazioni può ridurre la quantità di energia necessaria per la reazione e ridurre i sottoprodotti tossici. Tuttavia, l'uso di enzimi nell'industria è limitato, perché gli enzimi non sono stabili e possono essere costosi. Questo protocollo potrebbe ridurre la quantità di tempo necessaria per determinare se le condizioni sono deleterie per l'attività enzimatica, o se le modifiche all'enzima hanno aumentato la sua stabilità.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede meno ore uomo rispetto ai tradizionali test di stabilità enzimatica. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato con una vasta gamma di enzimi perché può essere utilizzato con qualsiasi reazione che rilascia o assorbe calore. Per iniziare, preparare 0,1 tampone molare di acetato di sodio.
Misurare 800 millilitri di acqua distillata in un bicchiere graduato da 1.000 millilitri. Quindi, pesare 8,2 grammi di acetato di sodio anidro e aggiungerlo al becher. Posizionare il becher su una piastra di agitazione.
Posizionare un'asta di agitazione nel becher e accendere la piastra di agitazione per mescolarla fino a completa dissoluzione. Quando l'acetato di sodio anidro è completamente sciolto, utilizzare un misuratore di pH calibrato per misurare il pH della soluzione. Utilizzare una pipetta per aggiungere 1 acido cloridrico molare o idrossido di sodio di conseguenza per ottenere il pH desiderato a 4.6.
Aggiungere acqua distillata nel becher fino a quando il volume totale raggiunge 1.000 millilitri. Per preparare la soluzione enzimatica, in un cilindro graduato da 15 millilitri, misurare 8 millilitri del tampone di acetato di sodio molare 0,1. Quindi, aggiungere la soluzione tampone in un tubo conico da 15 millilitri con enzima e agitare vigorosamente fino a quando l'enzima non si è sciolto.
Aggiungere più soluzione tampone fino a quando il volume totale raggiunge i 10 millilitri. Conservare la soluzione enzimatica a 4 gradi Celsius fino all'uso. Per preparare la soluzione del substrato, pesare il substrato e posizionarlo in un bicchiere da 100 millilitri.
Utilizzare un cilindro graduato per misurare 20 millilitri della soluzione tampone, quindi aggiungerlo al becher di vetro. Posizionare il becher su una piastra di agitazione e posizionare un'asta magnetica di agitazione nel becher. Accendere il fuoco e regolare di conseguenza la velocità di agitazione.
Lasciare continuare l'agitazione fino a quando il substrato non si è sciolto. Versare la soluzione del substrato in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere il tampone di acetato di sodio precedentemente preparato, fino a quando il volume totale è di 45 millilitri. Agitare il tubo per mescolare.
Conservare la soluzione del substrato a temperatura ambiente fino all'uso. Nel computer aprire Esecuzione ITC e fare clic su Configura. Fare clic sulla velocità di agitazione e impostare su 350 giri/min.
Controllare che la dimensione della siringa sia di 50 microlitri. Impostare la temperatura su 55 gradi Celsius e premere aggiorna. Attendere almeno un'ora prima di procedere, per concedere tempo sufficiente affinché lo strumento ITC si riscriva o si raffreddasse in base alle esigenze.
Prima di caricare l'enzima, assicurarsi che la cella di riferimento sia caricata con 350 microlitri di acqua distillata. Per pulire la cella campione, riempire la siringa di carico con 500 microlitri di soluzione detergente al 2%. Inserire con cura l'ago nella cella del campione, riempire la cella e rimuovere lentamente il liquido utilizzando la stessa siringa.
Smaltire il liquido in un becher. Ripetere questo passaggio due volte con una soluzione detergente al 2%, tre volte con il 70% di etanolo, quindi lavare dieci volte con acqua distillata. Dopo aver pulito la cella campione, riempire la siringa di carico con 450 microlitri di soluzione enzimatica.
Inserire con cura l'ago fino alla parte inferiore della cella del campione e premere lentamente lo stantuffo fino alla linea di 100 microliter per evitare la formazione di bolle d'aria. Quindi, lavare la siringa di titolazione da 50 microliter con acqua distillata tre volte posizionando la punta dell'ago nell'acqua per prendere lentamente l'acqua nella siringa, quindi erogando l'acqua in un contenitore di rifiuti. Risciacquare con la soluzione del substrato tre volte per rimuovere l'acqua residua.
Successivamente, riempire la siringa di titolazione con soluzione di substrato disegnando la soluzione fino a quando la siringa non è piena senza bolle d'aria. Con la siringa ancora nella soluzione del substrato, rimuovere lo stantuffo e consentire a circa 2 microlitri d'aria di entrare nella parte superiore della siringa e reinserire lo stantuffo. Rimuovere la maniglia del burette dell'ITC, posizionare la siringa all'interno della maniglia della burette e avvitare fino a quando non è stretta.
Pulire la punta della siringa di titolazione con un tessuto privo di pelucchi, quindi posizionare con cura il manico della burette nello strumento ITC e bloccarlo in posizione. Per l'impostazione dell'esperimento, selezionare titolazione incrementale. Fare clic su inserisci per impostare le iniezioni.
Regolare l'intervallo di iniezione a 5.400 secondi, il volume di iniezione a 4 microlitri e il numero di iniezioni a quattro. Premere OK per confermare le impostazioni. Nella casella di equilibrazione, selezionare l'equilibrio automatico e i grandi riscaldamenti previsti.
Impostare la linea di base iniziale su 300 secondi. Per iniziare l'esecuzione, fare clic sul simbolo iniziale accanto alla velocità di agitazione, quindi fare clic su Avvia, che si trova accanto al simbolo della chiave inglese. Salvare il file e consentire l'esecuzione dello strumento.
Per analizzare i dati, aprire il file in Nano Analyze. Fare clic sui dati e selezionare colonne di dati. Selezionare tutti i dati, copiarli e quindi incollarli in Microsoft Excel.
Regola 0 linea di base aggiungendo il valore richiesto a 300 secondi per renderlo 0. Applicare questa correzione all'intera colonna dei valori della velocità termica. Quindi, tracciare i grafici dei valori minimo o massimo rispetto al momento in cui il valore si è verificato durante la titolazione.
In questo protocollo, le tracce di dati ITC dell'attività della lattasi sono mostrate con quattro iniezioni sequenziali di lattosio in una soluzione di lattasi in tampone pH 4.6 a 55 gradi Celsius, 45 gradi Celsius, 35 gradi Celsius e 25 gradi Celsius. Un controllo non enzimatico è stato eseguito a 55 gradi Celsius per il calore della miscelazione. Per ogni iniezione di enzima, c'è un calore esotermico iniziale di miscelazione, e successivamente, l'idrolisi endotermica catalizzata dalla lattasi del lattosio si verifica fino al completamento della reazione e la velocità di calore ritorna alla linea di base.
Il picco endotermico minimo dopo ogni iniezione, è leggermente inferiore all'iniezione precedente a causa della diminuzione dell'attività enzimatica. Come previsto, la stabilità enzimatica per ogni iniezione diminuisce con l'aumentare della temperatura. L'esperimento di controllo mostra che l'attività della lattasi a 25 gradi Celsius ha avuto una diminuzione dell'8% dell'attività enzimatica, a causa della diluizione dopo quattro iniezioni.
Considerando che la quarta iniezione mostra una diminuzione del 73% nel saggio, la perdita effettiva di attività enzimatica è stata quindi del 65%. Pertanto, la diluizione della lattasi risultante da ogni iniezione, ha avuto un effetto relativamente piccolo dell'11% sull'attività enzimatica. È importante che il tampone utilizzato per realizzare le soluzioni enzimatica e del substrato sia abbinato il più strettamente possibile.
La mancata corrispondenza del pH o della concentrazione può causare un maggiore calore di miscelazione che può mascherare il calore di reazione. È possibile applicare questo protocollo allo studio degli enzimi e determinarne la stabilità misurando la velocità di rilascio o assorbimento del calore durante il corso di una reazione.
