هذا الفيديو يوضح كيفية إعداد نوعين مختلفين من الخلايا الركيزة ثقافة باستخدام نوع الكولاجين الأول و ثنائي الأبعاد وثلاثية الأبعاد طريقة الثقافة. ويعتبر أسلوب ثقافة ثلاثية الأبعاد للبيئة البيولوجية، مما يدل على كيفية إعداد بسهولة الركيزة ثقافة ثلاثية الأبعاد مفيد للدراسات. في العديد من أنواع الخلايا، على الرغم من استخدام الكولاجين نفسه، يختلف سلوك الخلية بشكل كبير بين ركائز ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.
باستخدام الركيزة ثقافة ثلاثية الأبعاد، يمكن بسهولة فحص سلوك الخلية التي هي أكثر مماثلة لتلك التي للكائنات الحية. هذه الطريقة بسيطة جدا وتتطلب الحد الأدنى من الكاشف الخاص. المظاهرة البصرية أمر بالغ الأهمية، لأنه في حين أننا نريد أن نثبت أن هذه الطريقة هي محاولة بسهولة، هلام ثلاثي الأبعاد هش، والتعامل معها بشكل صحيح مهم جدا.
للبدء، إعداد الوسط الثقافة المناسبة. للبدء في إعداد الكولاجين، ضع 10x PBS، والمياه الأيونية، والكولاجين، ولوحة ثقافة 96 بئرًا، وأنبوبًا فارغًا من ميليلتر على الجليد. باستخدام ماصة، إضافة 1.12 ملليلتر من المياه الأيونية إلى أنبوب 2 ملليلتر فارغة.
إضافة 200 ميكروليتر من 10x برنامج تلفزيوني إلى المياه ديوند، وتهز بلطف الأنبوب عدة مرات. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 0.66 ملليلتر من الكولاجين إلى أنبوب ميليلتر. بلطف وبسرعة يهز الأنبوب عدة مرات.
صب 100 ميكرولترات من هذا الحل الكولاجين في كل بئر من 96 بئر لوحة ثقافة، مع التأكد من تغطية كامل سطح الآبار. هز اللوحة بلطف باستخدام حركة من اليسار إلى اليمين. احتضان لوحة الثقافة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
ثم إمالة لوحة لتأكيد هلام من الكولاجين، ونقل لوحة الثقافة إلى مقعد نظيفة. صب بلطف 150 ميكرولترات من K110 على المواد الهلامية عن طريق الأنابيب على طول جدار البئر. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، نقل لوحة الثقافة إلى مقعد نظيف. مباشرة قبل الخلية ثقافة، استخدام ماصة لتجاهل بلطف K110. أولا استخدام ماصة لإضافة أربعة ميكرولترات من الكولاجين إلى 1.2 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك ملليمولار واحد في أنبوب 1.5 ملليلتر، ومزيج بلطف.
صب 100 ميكرولترات من هذا الكولاجين خليط في كل بئر من جديد 96-جيدا لوحة الثقافة. هز الطبق بلطف في حركة من اليسار إلى اليمين ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تجاهل حل الكولاجين.
باستخدام ماصة، وغسل كل بئر مع برنامج تلفزيوني. إضافة 150 ميكرولترات من 1٪ BSA وBBS إلى كل بئر من لوحة الثقافة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قبل استزراع الخلايا، تجاهل حل BSA 1٪.
للبدء، إعداد خلايا FEPE1L-8 وK110، التربسين، ومثبط التربسين كما هو مبين في بروتوكول النص. إزالة بعناية المتوسطة من طبق الثقافة، واستخدام ماصة لإضافة ثلاثة ملليلتر من 0.05٪التربسين. ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم استخدام المجهر النقيض من المرحلة في التكبير 10x للتحقق من انفصال الخلية من سطح طبق الثقافة. إضافة ثلاثة ملليلتر من مثبطات التربسين، واستخدام ماصة لجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.
بعد هذا، والتخلص من عظمى، وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من K110. استخدم المجهر على النقيض من المرحلة عند التكبير 10 مرات لحساب الخلايا، وتمييع الخلايا باستخدام K110 إلى كثافة خلايا تبلغ 50000 خلية لكل ملليلتر. بذور بلطف 0.1 ملليلتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة الثقافة عن طريق الأنابيب على طول جدار البئر.
احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لطول الوقت المناسب. أول مزيج 130 ميكرولترات من ملح تيترازوليوم وWST-8 مع 1.3 ملليلتر من K110 مسخ مسخ في أنبوب مليلتر اثنين. نقل لوحة الثقافة إلى مقعد نظيفة، واستخدام ماصة لتجاهل بلطف K110 من الآبار.
غسل بلطف بعيدا والخلايا غير مخصص مع K110. ثم إضافة 110 ميكرولترات من K110 مختلطة مع WST - 8 إلى كل بئر. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد ذلك، نقل لوحة الثقافة إلى مقعد نظيف. جمع 100 ميكرولترات من المتوسطة مكيفة من كل بئر، ونقلها إلى آبار جديدة 96-جيدا لوحة الثقافة. باستخدام قارئ microplate، وقياس امتصاص في 450 نانومتر، وتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة.
ويلاحظ مورفولوجيا الخلية على أشكال غير ليفية وfibril تظهر هنا. في الساعتين الأوليين من زراعة, الخلايا الالتزام وتنتشر على كلا الشكلين من الكولاجين. بعد ثلاثة أيام من البذر، تستمر الخلايا الموجودة في الشكل غير الليفي في الانتشار، وتزداد أعداد الخلايا، في حين تظهر الخلايا الموجودة على شكل الفايبر انتشار محدود.
تستمر خلايا FEPE1L-8 في الانتشار على الشكل غير الليفي للكولاجين من النوع الأول وعلى أسطح الطبق غير المعالجة. في المقابل، لا تتكاثر الخلايا على شكل فيبريل. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن هلام ثلاثي الأبعاد هش جدا.
يجب على المرء أن يكون حذرا لضمان أن الحل أو نصائح لا تأتي في اتصال مباشر مع المواد الهلامية. يمكن تعديل هذا الأسلوب بطرق عديدة. على سبيل المثال، لخلط مكونات غشاء العينة، يمكن للمرء أن يجعل الركيزة ثقافة الخلية التي تحاكي غشاء الطابق السفلي.
في حالات عديدة، وظائف المصفوفة خارج الخلية في الأجسام الحية غير معروفة. إلى الخلايا ثقافة على ثقافة ثلاثية الأبعاد، يمكن للمرء أن يفحص وظيفة مكون المصفوفة خارج الخلية التي هي أكثر مماثلة للجسم الحي. من خلال تطبيق تقنيات ثقافة الجل ثلاثي الأبعاد ، يمكن للمرء اختبار تركيز الأدوية في الخلايا بشكل فعال.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول، الذي يستند إلى غرضه، لتطوير ركائز معقدة لثقافة ثلاثية الأبعاد عن طريق خلط مكونات EGM الأخرى أو عوامل النمو أثناء الجلات.
