هذه الطرق يمكن أن توفر رؤى ميكانيكية في الخلايا المناعية التي تتوسطها الخلايا السرطانية السامة للخلايا والسلوك الغازي في بيئة 3D. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذا النموذج 3D spheroid ثقافة المشتركة لا يتطلب نقل spheroids لمقالات متعددة لاحقة. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون طالبة الدكتوراة من قسمنا.
لتوليد spheroids باستخدام تقنية معقمة في خلية ثقافة غطاء إضافة 500 microliters من agarose المنصهر في 81 ميكروويل المطاط العفن مع الحرص على تجنب فقاعات. عندما عززت agarose بعناية المرن العفن المطاط لموسيقى البوب أغاروز يلقي في الآبار الفردية من لوحة 12 جيدا. لتكاسير الخصيص إضافة 2.5 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة تكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية في كل بئر ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة إمالة لوحة لإزالة خلية ثقافة المتوسطة في محيط أولا، ثم في غرفة البذر وبذر بعناية 190 microliters من استعداد للأورام تعليق الخلايا قطرة في كل خلية بذر الغرفة. بعد 15 دقيقة حضانة في الحاضنة ثقافة الخلية إضافة في 2.5 ملليلتر من المتوسط إلى خارج المدلى بها والعودة لوحة إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة. لإعداد T-cell شارك في الثقافة resuspend العدد المناسب من الخلايا التائية في 190 microliters من ثقافة الخلايا التائية غير لائق، متوسطة في كل بئر حتى 12 جيدا لوحة للسماح لإزالة وسيلة ثقافة الخلية المحيطة أغاروز المدلى بها أولا.
ثم في غرفة البذر ، دون إزالة الإسفنج استخدام المجهر الخفيفة للتحقق مما إذا كان قد تم يستنشق أي spheroids وعقد P200 الماصات المحملة حوالي نصف سنتيمتر فوق كل يلقي بذور بعناية الخلايا التائية على يلقي بطريقة قطرة دون طرد السفح. عندما تم زرع جميع يلقي عاد بعناية لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة قبل إضافة ثقافة الخلايا الطازجة المتوسطة تستكمل مع مصل البقر الجنين إلى خارج كل المدلى بها لاحتضان آخر 48 ساعة. لتضمين الثقافات المشتركة 3D في نوع واحد الكولاجين تمييع الكولاجين مع مصل قاعدة حرة المتوسطة إلى تركيز العمل النهائي من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر وإضافة 11 ميكرولترات من 10X PBS، إضافة 1.2 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم الضرس واحد لكل 100 ميكرولتر من الكولاجين.
بعد تحييد حل الكولاجين على الجليد لمدة ساعة واحدة، وإزالة متوسطة ثقافة الخلية المحيطة وداخل كل المدلى بها كما هو موضح. إضافة بعناية الكولاجين تحييد خليط واحد إلى كل المدلى بها بطريقة قطرة، وعاد على الفور لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس دقائق قبل عكس لوحة لمدة ساعة إضافية في الحضانة. في نهاية الحضانة مكان لوحة الجانب الأيمن في غطاء محرك السيارة السلامة الحيوية وإضافة ببطء ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة أسفل الجانب من كل بئر.
ثم العودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة. لتلوين مناعي من الثقافات المشتركة 3D جزءا لا يتجزأ إصلاح كل يلقي agarose كاملة بما في ذلك spheroids في 5.4٪ formalin بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة. في اليوم التالي، وإزالة formalin المحيطة يلقي agarose واستخدام ملاقط تلميح أنيق لفهم زاوية كل مصفوفة الكولاجين للسماح يلقي أن تكون مقشر من غرف البذر في حركة سائل واحد.
ضع كل رقعة كولاجين في بئر واحد من شريحة غرفة بئر ثمانية وإضافة 250 ميكرولترات من 0.5٪ أوكوكسي نول كل إلى كل بئر. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة استبدال octoxynol مع 250 ميكرولترات من محلول الحجب. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة إضافة 250 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لكل بئر ووضع شريحة في غرفة مرطبة داكنة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
في صباح اليوم التالي إزالة الأجسام المضادة الأولية من كل بئر وغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميكرولترات من عازلة IF لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، أضف 250 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوية غير الملائمة لكل بئر لمدة ساعة واحدة حضانة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة إزالة الأجسام المضادة وغسل كل عينة ثلاث مرات مع عازلة IF كما هو موضح.
بعد غسل الماضي شطف العينات مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في بئر وإزالة بعناية جدران الشريحة الغرفة. بحيث يبقى فقط الشريحة الزجاجية في الجزء السفلي. إضافة 200 ميكرولترات من تصاعد المتوسطة إلى الشريحة الزجاجية وإسقاط بعناية زلة الغطاء على العينة دون خلق فقاعات ثم تخزين العينات التي شنت في مكان جاف مظلم بين عشية وضحاها قبل التصوير عن طريق المجهر الفلورانس هنا يمكن ملاحظة الاجهزة التجريبية النموذجية للمقايسات وأنها تسفر عن عينات تمثيلية وقابلة للتحليل في نهاية التجربة لكل بروتوكول يمكن ملاحظتها.
تضمين الثقافة 3D في نوع واحد الكولاجين داخل الآبار الصغيرة من يلقي agarose يسمح رصد وتحليل الغزو عن طريق الصورة J.In هذا التحليل من اثنين من المورين الأولية, لوحظ خطوط خلايا سرطان البنكرياس أشكال مختلفة كروية والسلوكيات الغازية. أظهرت الخلية الأولى خط واحد تشكيل اكر للزنجية أكثر وغزو شائك مماثلة لتلك التي لوحظت لغزوات خلية واحدة. في حين أن خط الخلية الثانية شكلت spheroids التي كانت أكثر فضفاضة وأظهرت نمط الغزو الجماعي.
يمكن إجراء ثقافة المشاركة مع اثنين من مختلف خطوط الخلايا السفلية الورم بذر في نفس الوقت أو مع الورم والخلايا التائية على تكوين الورم spheroid أو السرطان بعد ذلك تقييم التفاعل T-الخلية. للحصول على تقييم مفصل للسلوك الغازي التلطيخ المناعية وcon التصوير البؤري يمكن أن يؤديها بطريقة عالية الإنتاجية. يسمح يلقي agarose بتضمين نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد بالكامل في البارافين للتجزئة التسلسلية وتلطيخ المناعة لتحديد العلاقة المكانية بين الورم والخلايا التائية.
على سبيل المثال، يمكن التعرف على تسلل الخلايا التى وتتميز بتلوين علامة سطح الخلية. هذه التقنية تسمح لتحليل عينات المريض وكذلك استخدام الأدوية المحفزة ومنع التحقيق في الخلايا السرطانية T-cell التفاعلات.
