23- إن دور المعادن الانتقالية في تنمية الثدييات هو دور يُستهان به إلى حد كبير. تظهر الأدلة الناشئة أن التوازنات الفلزية لا تزال تتغير وفقا للمرحلة التنموية للخلايا والأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإن الوجهات الخلوية المحددة للمعادن أيضا varietal في التنمية، وبطبيعة الحال، فإنه من الصعب تحديد مواقعها.
وقد تم حتى الآن تطوير تقنيات تحليلية مختلفة لتحديد المعادن كمياً، ولكن معظمها باهظ الثمن أو يتعذر الوصول إليه. وتركز البحوث المكثفة لتحسين تحديد المعادن بطريقة أكثر سهولة وكفاءة. الجرافيت الفرن الطيفي الامتصاص الذري، GF-AAS، واثنين من المزايا الرئيسية.
ويوفر حدوداً منخفضة للكشف عن الزنك، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق للزنك. بل هو أيضا تقنية التي لا تتطلب كميات كبيرة من العينة، microliters من الحل تميل إلى أن تكون كافية لتنفيذ التحليل. الجمع بين هاتين المزايا جعل GF-AAS مثالية لتحليل العناصر النزرة في عينات ذات حجم منخفض.
ترتبط العديد من الحالات المرضية البشرية باختلال التوازن المعدني. بعض الأمثلة هي فقر الدم، التهاب الأكروبرمات المعوي، ومرض ويلسون و Menkes'. ولذلك، من المهم تطوير أساليب فعالة وموثوق بها لقياس مستويات المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية مع حساسية عالية ودقة عالية.
GF-AAS هو مثال ممتاز على التكنولوجيا التي تسهل تحديد أي معدن معين في الظروف الفسيولوجية العادية، وفي الحالات المسببة للأمراض. الأسلوب هو تنوعا للغاية. ويمكن تطبيقه على العديد من النظم والعديد من العناصر يمكن تحليل باستخدام GF-AAS.
ويتمثل التحدي في تحديد حد طريقة الكشف في الواقع، والتأكد من أن العينات تقع ضمن هذا الحد. وبالنظر إلى أن حجم العينات منخفض، فليس هناك مجال كبير للاختبار، لذا يجب إجراء فحص دقيق للبيانات منذ البداية. بعد التحليل الأول للعينات، نحن بحاجة إلى تحديد ما هو عامل التخفيف اللازم لتحقيق العينات إلى الحدود المطلوبة لتحديد الكمية.
تأكد من أنك قادر على تجزئة النوى بشكل صحيح قبل الذهاب إلى AAS. البقع الغربية هي دائما التحقق من صحة جيدة قبل التحليل الطيفي. بينما يتطلب GF-AAS كميات منخفضة، برك داخل الخلايا هي في أحجام منخفضة بالفعل.
هذا لا يعطي مجالاً كبيراً للاختبار يجب إجراء القياسات الأولى وفحصها بعناية ، لذلك يمكن تقليل المعالجة بالعينة إلى عامل تخفيف واحد فقط. للبدء، ثقافة الخلايا ذات الاهتمام في لوحات 55 سم مربع.
استخدام فخ فراغ لpirate وسائل الإعلام الثقافة. تأكد من إزالة جميع آثار الوسائط. استخدام الثلج البارد برنامج تلفزيوني خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم لشطف الخلايا من النقاط الزمنية المطلوبة، أو ظروف الثقافة، ثلاث مرات.
ثم إضافة ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS إلى لوحة، وكشط الخلايا قبالة لوحة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر، والاحتفاظ بها على الجليد. الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 10، 000 مرة G، وإزالة المابير من قبل الطموح.
إذا كان من المطلوب تحليل المعادن من الكسور السيتوبلازمية والنووية، resuspend بيليه الخلية في 400 ميكرولترات من الجليد البارد PBS التي تحتوي على 0.1٪ NP-40، وهو المنظفات غير الأيونية. نقل 100 ميكرولترات إلى أنبوب microcentrifuge جديدة كعينة الخلية بأكملها، وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لعزل النوى، استخدم طرف P1000 micropipette إلى ماصة تعليق الخلية 400 ميكرولتر صعودا وهبوطا خمس إلى 10 مرات على الجليد.
ثم، استخراج خمسة ميكرولترات من تعليق الخلية ونقلها إلى شريحة زجاجية المجهر. ضع الميكرولترات الخمسة تحت مجهر خفيف باستخدام هدف 40 مرة للتحقق من سلامة النوى. الطرد المركزي المتبقية 395 microliter خلية تعليق lysate لمدة 10 ثانية في 10، 000 مرة G.Transfer supernatant التي تحتوي على كسر cytosolic إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
المقبل، إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.1٪NP-40 لشطف بيليه مع الكسر النووي، والطرد المركزي لمدة 10 ثوان في 10، 000 مرة G.Remove supernatant، و resuspend بيليه تحتوي على نواة في 100 ميكرولترات من نفس الحل. لlyse الخلايا، واستخدام Bioruptor ل sonicate الخلية بأكملها والنوى التي تحتوي على حل ثلاث مرات، كل لمدة خمس دقائق. المضي قدما في تنفيذ مراقبة الجودة من نقاء الكسور بواسطة لطخة الغربية، وذلك باستخدام الأجسام المضادة محددة لكسور إما النووية أو cytosolic.
أولا، إضافة حجم متساو من حمض النيتريك المركزة من الصف المعادن النزرة إلى الخلية بأكملها، والكسور السيتوبلازمية والنووية التي تحتوي على 100 و 500 و 100 ميكرولترات من تعليق الخلية في أنابيب ميكروسيرت 1.5 ملليلتر، ووضعها في كتلة حرارية في 80 درجة مئوية لتكميل ثقافة الخلية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أخرج الأنابيب من الكتلة الحرارية ووضعها في رف لمواصلة الهضم الحمضي بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. وقف التفاعل عن طريق إضافة 30٪ من حجم العينة من بيروكسيد الهيدروجين.
جلب حجم العينة إلى 500 ميكرولترات مع 18 ميجا أوم تنقية المياه. بعد ذلك، في أنبوب فالكون 15 ملليلتر يخفف من مستوى التحليل الصف أكسيد النيتريك في الماء النقي في 18 ميجا أوم لإعداد اثنين من حجم في المئة محلول حمض النيتريك كحل فارغ أثناء المعايرة. ثم، استخدم محلول حمض النيتريك بنسبة 2 في المائة لتخفيف محلول مخزون الزنك المتاح تجارياً 1000 جزء في المليون بتركيز 1000 جزء في البليون.
إعداد حلول معيار العمل من 1، 000 جزء لكل مليون حل الزنك القياسية، و1، 000 جزء في مليار الحل، ثم تمييعه إلى 5، 8، 10، 15، 20، و 25 جزء في المليار مباشرة مع 2 حجم محلول حمض النيتريك. ضع ملليلتر واحد من 0.1٪ من مُعدّل مصفوفة نترات المغنيسيوم في أكواب عينة البولي بروبلين، ثم قم بتحميل الأكواب في الـ autosampler. قم ببرمجة مطياف الامتصاص الذري لإضافة خمسة ميكروليتر تلقائياً من معدّل المصفوفة إلى معايير الزنك والفراغ.
تعيين نفس الشرط الأمثل على مطياف الامتصاص الذري للحلول القياسية والعينات، مع معدل تدفق مقدمة في 250 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، ودرجة حرارة الحقن في 20 درجة مئوية، ودرجة حرارة الفرن الجرافيت تصل إلى 1، 800 درجة مئوية في أربع عمليات الخطوة. وينبغي قياس جميع المعايير والعينات لتجربة واحدة في نفس الوقت لتجنب الأخطاء بسبب اختلافات المعايرة أو التبخر. تحسين مصباح C-HCL إلى تيار من 20 أمبير، الطول الموجي من 213.9 نانومتر، ومشقوق من 0.7 نانومتر.
الميبت العينات في أكواب عينة البولي بروبلين، ووضعها في كاروسيل autosampler. الحد الأدنى للكشف عن الزنك هو 0.01 جزء في البليون. ومن خلال زيادة تركيز المعايير، يتحدد الحد الأعلى للكشف عن الزنك بـ 20 جزءاً في البليون.
بعد الحصول على منحنى الزنك القياسي، وقياس العينات معدن لتحديد المحتوى المعدني. إذا كانت البيانات التي تم الحصول عليها تتجاوز حد الكشف، تمييع العينات مع 18 ميجا أوم المياه النقية المعالجة مع 0.1٪ تحليلية الصف حمض النيتريك. في هذه العزلة السريعة للبروتوكول النووي، تظهر البقعة الغربية التمثيلية من التفريق بين الكائنات العضلية الأولية نقاء الكسور دون الخلوية.
تم استخدام إنزيم chromatin إعادة عرض Brg1 لتحديد الكسر النووي، واستخدمت tubulin لتحديد الكسر السيتوسوليك. ويبين هذا الشكل ميكروجرافات ضوئية تمثيلية لطبقات أحادية متكاثرة ومتميزة أو التقاء لكل نوع خلية، ومحتوى الزنك المقابل في مستخلصات الخلايا الكاملة والكسور الخلوية والنووية. وأظهرت جميع خطوط الخلايا التي تم تحليلها في هذه الدراسة تركيزات الزنك في نطاق نانوموللار.
أظهرت ميوتيوب الأولية المتمايزة مستويات أعلى من الزنك من الخلايا المتكاثرة. تم الكشف عن توزيع شبه الخلية مماثلة من الزنك في الخلايا العصبية المشتقة خط N2A. من ناحية أخرى، أظهرت الخلية 3T3-L1 القائمة مستويات أعلى من الزنك عندما كانت الخلايا قبل الخلايا الشحمية تتكاثر مما كانت عليه عندما كانت مستحثة أو متباينة.
وأظهرت خلايا MCF10A مستويات متساوية من الزنك بين الكسور السيتوسولية والنووية في الخلايا المتكاثرة. مرة واحدة الخلايا MCF10A الوصول إلى التقاء, تم الكشف عن انخفاض 40٪ في مستويات الزنك الخلية الكاملة, ووجد أن المعدن أن تكون أكثر تركيزا في كسر السيتوسوليك. الجرافيت الجرافيت قياس الطيفية امتصاص الذر atomic فرن هو تقنية حساسة للغاية لقياس التحول والمعادن الثقيلة في العينات البيولوجية والبيئية.
وينبغي توخي عناية خاصة والنظافة في إعداد الكسور دون الخلوية، حيث من المرجح أن يتداخل الحد الأدنى من التلوث مع التحليل، وذلك بسبب حساسية المعدات. ونظراً لانخفاض كميات المعادن ومستوياتها في كل تجربة، من الصعب التفكير في تقنية أفضل وأكثر دقة لقياس الزنك من GF-AAS. لا توجد تقنيات حالية يمكن أن توفر حدود الكشف والحجم المنخفض المطلوب بتكلفة منخفضة نسبيا من GF-AAS.
الجرافيت الجرافيت قياس الطيفية امتصاص الذر atomic فرن دقيق وحساسة وفعالة من حيث التكلفة، ويمكن الوصول إليها. وسيستمر هذا الأسلوب التحليلي في التحسن مع استمرار تقدم تكنولوجيات الكشف عن العناصر. وسوف يشمل التطبيق المستقبلي للكشف عن الزنك والمعادن الأخرى بواسطة GF-AAS الأعضاء والأنسجة التي يتم الحصول عليها من النماذج الحيوانية، والخزعات من المرضى الذين يعانون من أمراض مرتبطة باختلالات المعادن النظامية.
حمض النيتريك هو حمض تآكل للغاية قادرة على التسبب في حروق كيميائية شديدة بسرعة كبيرة. هذه المادة الكيميائية يمكن أيضا أن تتفاعل بعنف مع بعض المركبات مثل مساحيق معدنية. بسبب الخطر الذي يشكله حمض النيتريك، من المهم اتخاذ تدابير سلامة صارمة عند التعامل مع حمض النيتريك.
عند التعامل مع حمض النيتريك نوصي بشدة ارتداء النظارات الكيميائية السلامة، درع الوجه للحماية من البداية، والقفازات، والتنفس البخار المعتمدة إذا التهوية ليست كافية.
