يوضح بروتوكولنا سير عمل شامل قبل الفحص لاختبار الفعالية العلاجية للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان بعد إصابة الدماغ. هذا النموذج من إصابات الدماغ الرضية يوفر درجة عالية من التنوع والتكرار من خلال التحكم بإحكام في المعلمات من القوة الميكانيكية، وبالتالي توفير إصابة محددة جيدا. يمكن استخدام هذه الإجراءات لدراسة الإصابات وعمليات التعافي في مناطق الدماغ الأخرى وطريقة الزرع قابلة للاستخدام مع العديد من أنواع الخلايا.
الحفر القحفي هو التحدي كما يتطلب هذا الأسلوب البراعة اليدوية لإتقان الضغط المناسب, سرعة, عمق, والحركات على نحو سلس. توثيق جميع الأحداث والممارسة على نطاق واسع. لإجراء عملية استئصال الرحم أحادية الجانب، تأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع قدم في الماوس المُجَنَّد وتأمين الماوس في إطار مجسم.
تطبيق مرهم العيون المضادات الحيوية على العينين مع مسحة القطن العقيمة والمحلول القائم على اليود لمنطقة فروة الرأس حلق. إزالة اليود مع 70٪ الإيثانول وتغطية الحيوان مع ستارة الجراحية fenestrated. جعل شق 1.5 إلى اثنين سنتيمتر خط الوسط على فروة الرأس واستخدام مسحات القطن العقيمة لتنظيف الجرح وتصفية اللفافة اليسرى من خط الوسط في البريغما.
استخدام مسبار impactor لتحديد موقع استئصال الرحم وتعيين x يساوي الصفر، y يساوي صفر نقطة مرجعية stereotaxic إلى bregma. ضبط المجس بشكلٍ مُشْتَرَفَيًا إلى اثنين مليمترات يسار خط الوسط. استخدام علامة غرامة تلميح آمنة جراحيا إلى معلم دائرة قطرها خمسة ملليمتر حول منطقة تأثير افتراضي.
رفع وتدوير impactor للخروج من الموقف واستكمال دائرة 5 ملليمتر. إرجاع لفترة وجيزة impactor في موقف للتحقق من دقة دائرة 5 ملليمتر. ثم رفع وتدوير impactor للخروج من الموقف واستخدام عالية السرعة الروتاري محرك السيارات أداة يدوية مجهزة بقشيش جولة 0.6 أو 0.8 ملليمتر حفر دبر بت لجعل حفرة مفتوحة في الجمجمة في 70 إلى 80٪ أقصى سرعة.
تطبيق الضغط الخفيف على الجمجمة أثناء الحفر على طول المخطط محيطي 5 ملليمتر داخل هذه الحدود واستخدام ملقط لرفع رفرف العظام الناتجة. قد الحفر من خلال خطوط خياطة تقدم صعوبة إضافية كما يتم مقاطعة العظام ويتطلب ضغطا إضافيا. قد تكون الأوعية الدموية في ارتباط وثيق وبالتالي من المرجح أن تكون أحداث النزيف.
للحث على إصابة خفيفة التأثير القشرية، تنظيف مسبار المؤثر مع وسادة إعداد الكحول العقيمة ونقل مسبار الارتطام مرة أخرى إلى الموقف على القشرة المكشوفة. خفض المسبار حتى اللمسات على السطح ماطر dura ووضع علامة على هذا الموقف z يساوي صفر. سحب المكبس والانتقال إلى z يساوي ناقص ملليمتر واحد والتفريغ المكبس للتأثير على القشرة.
رفع المكبس على الفور وتحريك الذراع للخروج من الموقف وري القشرة مع حجم سخية من المالحة واستخدام غرز انقطاع بسيطة و 5-0 خياطة الحرير لإغلاق شق فروة الرأس. ثم تسليم 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من السيكلوسبورين A عن طريق الحقن تحت الجلد في scruff ووضع الماوس في قفص ما بعد العملية النظيفة قبل الدفء مع الرصد حتى الشفاء الكامل. بعد حوالي 24 ساعة من عملية استئصال الزانية، ضع الماوس مرة أخرى في الإطار المجسومي.
تغطية الماوس مع الستار الجراحي fenestrated. Lavage موقع شق مع المالحة العقيمة لتنظيف الموقع وتخفيف الغرز. استخدام 70٪ الايثانول من القطن غارقة مسحة لتعقيم بلطف موقع شق واستخدام ملاقط غرامة ومقص العيون لإزالة الغرز.
ثم ري الجراحة وcraniectomy الموقع مع المالحة العقيمة وفيرة. في غطاء غطاء غطاء لثقافة الخلية للسلامة البيولوجية، يُدوال بلطف أو ينقر على أنبوب الخلايا لضمان تعليق الخلية المتجانسة. استخدام micropipette لتحميل ما يقرب من 7.5 ميكرولترات من الخلايا في حقنة هاملتون من خلال نهاية المكبس.
عقد حقنة في زاوية 120 درجة مع نهاية المكبس التي تواجه أسفل، إدراج المكبس مع الحرص على عدم إدخال فقاعة الهواء بين تعليق وطرف المكبس. نعلق تجميع طوقا لإبرة ماص وأرفق الإبرة إلى الحقنة. دفع المكبس لتحريك تعليق الخلية في إبرة ماصة وإرفاق حقنة إلى مضخة حقنة stereotaxic.
تقدم المكبس للتأكد من أن الجمعية مضخة حقنة يعمل بشكل صحيح ونقل الإبرة في إحداثيات للحقن. محاذاة تلميح إبرة إلى bregma وتعيين س و ص الإحداثيات إلى الصفر. حرك طرف الإبرة فوق استئصال الغشاء القراني إلى ملليمترين جانبي ونيازر ملليمتر واحد خلفي إلى بريما والمس طرف الإبرة إلى سطح الجافا.
رفع الإبرة قليلا ثم جعل شق صغير في ماتر دورا في المكان الذي جعل الإبرة الاتصال. تعيين إحداثيات stereotaxic إلى z يساوي صفر ودفع المكبس للتأكد من أن تعليق الخلية تتدفق بشكل كاف قبل إدخال الإبرة في الدماغ. إدخال الإبرة في الدماغ إلى عمق z يساوي ناقص 1.4 ملليمتر لوضع الكسب غير المشروع في المادة الرمادية / الحدود المادة البيضاء من القشرة العميقة.
بدء ضخ حقنة لضخ تعليق الخلية على مدى فترة 15 دقيقة. استخدام مجهر لمسافات العمل الطويل لمراقبة تدفق تعليق الخلية ري موقع الجراحة مع المالحة العقيمة أثناء الحقن للحفاظ على ترطيب الأنسجة. عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، اسحب إبرة الزرع ببطء واروي موقع الجراحة بملوحة إضافية قبل إغلاق الشق مع خياطة جديدة.
ثم تقديم الرعاية بعد الجراحة كما هو موضح. لاختبار إزالة الشريط اللاصق، استخدم أولا سكين حلاقة صغيرة لقطع القطع الصفراء والحمراء من الشريط الكهربائي إلى ثلاثة من خمسة ملليمترات شرائط على سطح الزجاج الملساء. جلب الفئران في غرفة اختبار السلوك لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار واستخدام القماش التعامل مع لكبح جماح الماوس من قبل scruff من الرقبة والعودة بحيث الماوس يحمل forepaws بعيدا عن الجسم والرأس.
استخدام ملاقط لوضع شريط لاصق على سطح plantar من كل forepaw واستخدام ضغط الإصبع حساسة ومتسقة لتأمين الشرائط إلى الكفوف. ضع الماوس بسرعة في اسطوانة بلاستيكية وابدأ ساعتي إيقاف عندما يكون الماوس لديه كل الكفوف الأربعة على مربع الاختبار البلاستيكي. ثم استخدام ساعتي الإيقاف لتسجيل الراحتين لإشعار مخلب اليسار، وإزالة مخلب اليسار، إشعار مخلب الحق وإزالة مخلب الحق.
في هذه التجربة التجريبية، تمت مقارنة وظيفة forelimb في استئصال الكرانيكتوم وحده، والسيطرة على إصابة ارتطام القشرية والفئران الساذجة. الفئران التي خضعت لعملية جراحية أظهرت التأخّر العابرة لاحظت محفزات لاصقة لمدة يوم إلى ثلاثة أيام مباشرة بعد الجراحة والعجز العابر بعد الجراحة في إزالة لاصقة من الوَبْاوِةِ المتوسطة. الفئران التي خضعت لتأثير القشرية التي تسيطر عليها، ومع ذلك، أظهرت عجزا كبيرا في الأداء الحركي في شطاف contralateralال إلى الإصابة مقارنة الفئران الساذجة من يوم ما بعد العملية 28.
ويكشف الكبت المناعي لأقسام دماغ الماوس للمستضد النووي البشري أن ترقيع الخلايا البشرية يمكن تمييزها بوضوح عن الأنسجة المضيفة في إصابة SHAM والتحكم في أدمغة التأثير القشرية. يجب مراعاة إجراءات السلامة المختبرية القياسية عند التعامل مع الخلايا البشرية المستزرعة وعند التعامل مع إبر الحقن التي تتلامس مع القوارض أو الأدوية المثبطة للمناعة. يمكن تحليل أقسام أنسجة المخ للتعبير عن علامات الأعصاب العصبية حيث أنها قيمة لمعرفة كيف يؤثر الكسب غير المشروع على استجابة إصابة الأنسجة المضيفة والعكس بالعكس.
فوجئنا بالعثور على اختلافات جنسية خفية في نتائج سلوك ما بعد الإصابة. نحن نحقق الآن فيما إذا كان الجنس يلعب دورًا في استجابة المناعة العصبية لإصابات الدماغ. الأيدي الثابتة، والصبر، والممارسة حاسمة لتطوير تقنية استئصال القرانية جيدة.
يمكن أن الأضرار الجانبية من استئصال craniectomy غير لائقة للخطر المنطقة التي تريد استهداف لزرع الخلايا.
