مع الاهتمام المتزايد بالعلاجات الخلوية ، هناك حاجة إلى طرق جديدة لتقييم وظائف هذه الخلايا. يسمح هذا البروتوكول في المختبر بتقييم طويل الأجل لهذه الخلايا في سياق عصبي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن جميع المكونات تأتي من أصل بشري.
أيضا ، يمكن تتبع engraftment بسهولة ، ويمكن تغيير البيئة من العضو العضوي بسهولة ، مما يسمح باختبار أدوية مختلفة أو نوع من العلاجات. ستثبت هذه التقنية إليانا إيبانيز ، طالبة دكتوراه موهوبة في مختبري. ابدأ بإزالة معلق الخلية الواحدة للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو الخلايا السلفية العصبية المشتقة من iPSC ، أو NPCs ، من الجليد وطردها مركزيا عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية.
قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 3 ملليغرام لكل ملليلتر من مصفوفة الغشاء القاعدي القابل للذوبان للحصول على حجم نهائي يبلغ 2 ميكرولتر لكل حقنة. ضع التعليق على الفور على الجليد حتى الاستخدام. انقل المحقنة المبردة مسبقا من الفريزر بدرجة حرارة 20 درجة مئوية إلى دلو ثلج لمزيد من الاستخدام.
بعد ذلك ، قم بإزالة الصفيحة العضوية في الدماغ من الحاضنة ونقل العضو العضوي إلى طبق 35 ملم باستخدام طرف تجويف واسع. لتحقيق الاستقرار في المواد العضوية وتسهيل الحقن ، قم بإزالة الوسط قدر الإمكان دون الإضرار بالعضو العضوي. ضع الطبق 35 ملم الذي يحتوي على العضو العضوي تحت مجهر تشريح لتسهيل الحقن.
بمجرد أن تصبح المواد العضوية جاهزة للحقن ، أعد تعليق خلايا NPC المسماة EGFP برفق باستخدام طرف ماصة P20 مبرد ، وانقل ميكرولتر من هذه الخلايا إلى شريحة زجاجية معقمة مبردة مسبقا. خذ حقنة أنسولين مملوءة مسبقا من الجليد وارسم ببطء 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع توجيه شطبة الإبرة لأسفل. افتح غطاء الطبق الذي يحتوي على العضو قبل تركيز المجهر عليه.
امسك الطبق بيد واحدة ، ضع شطبة الإبرة. ومن ناحية أخرى ، قم بحقن الخلية ببطء في السطح العضوي. بعد حقن الخلايا ، ضع الغطاء مرة أخرى في الطبق واحتضان العضو المحقون لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
بعد ذلك ، أضف برفق 500 ميكرولتر من الوسط العضوي إلى اللوحة قبل نقل العضو العضوي إلى لوحة ذات 24 بئرا بطرف تجويف عريض. احتضان العضو العضوي عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع تغيير متوسط كامل كل يومين. قم بتحميل عضوي تحكم غير محقون أو سلبي في مجهر مضان.
واضبط شدة الإضاءة بين 1 و 2 ووقت التعرض بين 80 و 100 مللي ثانية للحد الأدنى من التألق الذاتي. بعد ذلك ، قم بتحميل عنصر التحكم الإيجابي العضوي وارفع وقت التعرض للتأكد من أن الخلايا المسماة مرئية. أعد وضع العضو العضوي بطرف ماصة عريض التجويف للعثور على البروتين الفلوري الأخضر المحسن أو منطقة EGFP plus للحقن.
قم بإزالة الوسط تماما من العضو العضوي قبل تحميل العضو العضوي. وصورها بالإعدادات المحددة. بمجرد اكتمال التصوير ، أضف على الفور وسيطا جديدا لمنع العضو العضوي من الجفاف.
بعد تكرار إزالة الوسط والتصوير لجميع الكائنات العضوية ، أعد الكائنات العضوية إلى الحضانة الطبيعية والتغيرات المتوسطة. كرر التصوير على الفترات المرغوبة. ضع الشريحة في جرة تلطيخ شرائح كوبلين المملوءة بالتولوين لمدة دقيقتين ، وكرر هذه الخطوة.
بعد ذلك ، انقل الشريحة الزجاجية إلى جرة تلطيخ شرائح كوبلين الزجاجية المملوءة بالكحول الإيثيلي بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين. وكرر هذه الخطوة قبل نقل الشريحة إلى جرة كوبلين مملوءة بالماء لمدة دقيقتين. كرر الغسيل بالماء.
بعد ذلك ، ضع وعاءا بلاستيكيا في الحمام المائي ، مع التأكد من أن البلاستيك لا يلمس قاع الحمام. صب المخزن المؤقت للسيترات داخل الحاوية البلاستيكية واتركه يصل إلى 95 إلى 100 درجة مئوية. بمجرد وصول المخزن المؤقت إلى درجة الحرارة المطلوبة ، ضع الشرائح داخل المخزن المؤقت ، وقم بتغطية الحاوية بشكل غير محكم بغطاء ، وترك الشرائح داخل حمام مائي لمدة 30 إلى 40 دقيقة.
بعد الحضانة ، أخرج الحاوية البلاستيكية من الحمام المائي واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة دقيقتين لكل منها باستخدام برنامج تلفزيوني. قم بإزالة PBS بمنديل ورقي دون لمس العينة.
تحضير العازلة نفاذية وملء جرة تلطيخ الشريحة الزجاجية معها. اغمر الشرائح في المخزن المؤقت للنفاذية واحتضانها لمدة 10 دقائق. كرر ثلاث غسلات من برنامج تلفزيوني لمدة دقيقتين لكل منهما.
بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج تلطيخ لتغطية كل عينة وإضافة 25 ميكرولتر إلى الشريحة العضوية قبل احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، كرر ثلاث غسلات من PBS لمدة دقيقتين لكل منهما ، وقم بإزالة الأملاح عن طريق شطف الشريحة بالماء المقطر داخل جرة تلطيخ الشريحة الزجاجية. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من حوامل السائل و DAPI إلى كل عينة قبل تصوير الشريحة باستخدام المجهر الفلوري.
إلى جرة تلطيخ كوبلين الزجاجية المملوءة في منتصف الطريق بمخزن مؤقت للتبريد 2X ، أضف 45 مل من PBS ، وضع الشرائح داخل هذه الجرة. احتضان الجرة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. استخدم الفحص المجهري الفلوري للتحقق مما إذا كانت الفلوروفورات قد تم إخمادها بشكل فعال قبل تكرار التلوين والتصوير.
كان الاعتماد الواضح على جرعة مضان GFP موجودا على رقم خلية الإدخال ، مع اكتشاف EGFP بالإضافة إلى رقعة الخلية عند 10،000 خلية وما فوق. أظهرت المواد العضوية المحقونة والضوابط التي تم تصويرها لإيجابية EGFP استمرار الموقع المحقون طوال فترة التتبع التي استمرت أربعة أشهر. ظهرت بقع خلايا إيجابية إضافية من EGFP بعد تسعة أيام من الزرع واستمرت حتى نقطة نهاية الدراسة ، مما يشير إلى هجرة الخلايا والتكامل في مواقعها الجديدة.
عند التكبير العالي ، كان من الممكن ملاحظة التشكل العصبي الواضح مع إسقاطات طويلة في العضو العضوي ، مما يؤكد تكامل الخلايا المحقونة. أكد التلوين الأولي للجولة الواحدة وجود خلايا EGFP plus في موقع الحقن ، بما في ذلك خليط من الخلايا التي تحتفظ بحالة NPC ، وتلك التي تمايزت نحو مصير عصبي. بالنسبة للتحكم وحقن المواد العضوية ، لوحظ عدد قليل جدا من Nestin plus NPCs ، مع غالبية TUJ1 بالإضافة إلى الخلايا العصبية الناضجة غير الناضجة.
أعطى التلوين الدائري مزيدا من التفاصيل ، وكشف عن الخلايا العصبية الناضجة حول معظم المنطقة الخارجية للعضوي ، مع وجود مناطق من الخلايا العصبية غير الناضجة باتجاه المنتصف. كانت الخلايا النجمية موجودة في المواد العضوية المحقونة والتحكم ، وكانت تتخللها حول الحواف الخارجية. أظهرت الشريحة التي تم إجراء تلطيخها الدائري في العضو المحقون مستعمرة صغيرة تابعة ل EGFP بالإضافة إلى خلايا بعيدة عن موقع الحقن الذي اعتمد النمط الظاهري للخلايا العصبية الناضجة.
يبدو أن بعض هذه المستعمرات قريبة من الخلايا النجمية. ومع ذلك ، لا توجد خلايا EGFP plus ذات تداخل كامل مع تلطيخ GFP تشير إلى أنها كانت متجاورة بدلا من توليد الخلايا النجمية نفسها. عندما تقوم بحقن العضو العضوي ، يجب عليك تجنب استخدام الكثير من القوة أو القيام بذلك بسرعة كبيرة ، حيث يمكنك تدمير العضو العضوي تماما.
لذلك ، بعد تتبع الحياة ، يمكن ربط المواد العضوية واستخدامها لتحليل التدفق الخلوي ، أو نهج تسلسل الخلية الواحدة. سيسمح لنا ذلك بمعرفة الحالة الجزيئية للخلايا. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة للغاية لتطوير العلاج الخلوي للأمراض التنكسية العصبية ، وكذلك لنمذجة أورام المخ أو ورم خبيث.
