우리의 프로토콜은 뇌 손상 후 인간 유발 만능 줄기 세포의 치료 효능을 테스트하기위한 포괄적 인 전임상 워크플로우를 보여줍니다. 외상성 뇌 손상의이 모델은 기계적 힘의 매개 변수를 단단히 제어하여 잘 정의 된 부상을 제공함으로써 다재다능함과 재현성을 높입니다. 이러한 절차는 다른 뇌 영역에서 부상 및 회복 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 이식 방법은 많은 세포 유형과 함께 사용할 수 있습니다.
두개골 드릴링은 적절한 압력, 속도, 깊이 및 부드러운 움직임을 마스터하기 위해 수동 손재주가 필요하기 때문에 도전적입니다. 모든 사건을 문서화하고 광범위하게 연습하십시오. 일방적인 craniectomy를 수행하려면 마취 된 마우스의 발가락 핀치에 대한 응답부족을 확인하고 입체 프레임에 마우스를 고정하십시오.
살균면 면봉과 요오드 기반 용액을 면도두 부위에 적용하여 눈에 항생제 안과 연고를 적용하십시오. 70%에탄올로 요오드를 제거하고, 귀향 수술 커튼으로 동물을 덮습니다. 두피에 1.5~2센티미터의 중간절개를 하고 멸균 면봉을 사용하여 상처를 청소하고 브레그마의 미드라인의 왼쪽 근막을 치웁울 수 있습니다.
충격기 프로브를 사용하여 craniectomy 사이트를 식별하고 x를 0과 같게 설정하면 y는 bregma에 대한 제로 입체 기준점과 같습니다. 프로브를 중간선의 왼쪽 2밀리미터로 측면으로 조정합니다. 미세 팁 수술 안전 마커를 사용하여 추정 충격 영역 주위에 직경 5mm 의 원을 랜드 마크.
임펙터를 제자리에서 들어 올리고 회전하고 5밀리미터 원을 완성합니다. 5밀리미터 원의 정확도를 확인하기 위해 임펙터를 위치로 간단히 반환합니다. 그런 다음 임펙터를 제자리에서 들어 올리고 회전시키고 라운드 팁 0.6 또는 0.8 mm 버 드릴 비트가 장착된 고속 회전 마이크로 모터 키트 핸드 툴을 사용하여 70 ~ 80 %의 최대 속도로 두개골에 열린 구멍을 만듭니다.
이 테두리 내의 5밀리미터 원주 윤곽선을 따라 드릴링하는 동안 두개골에 가벼운 압력을 가하고 집게를 사용하여 생성된 뼈 플랩을 들어 올립니다. 봉합사 라인을 통해 드릴링은 뼈가 중단되고 추가 압력이 필요하므로 추가적인 어려움을 초래할 수 있습니다. 혈관은 가까운 연관에 있을 수 있습니다 및 따라서 출혈 이벤트는 가능성이 높습니다.
가벼운 제어 피질 충격 손상을 유도하기 위해 멸균 알코올 준비 패드로 임펙터 프로브를 청소하고 충격기 프로브를 노출된 피질 위로 다시 위치로 이동시합니다. 두라 마터 표면에 닿을 때까지 프로브를 낮추고 z가 0과 같을 때 이 위치를 표시합니다. 피스톤을 철회하고 z로 이동마이너스 1 밀리미터와 피스톤을 배출하여 피질에 영향을 미칩니다.
즉시 피스톤을 들어 올리고 팔을 위치에서 옮기고 식염수의 넉넉한 볼륨으로 피질을 관개하고 간단한 중단 된 바늘과 5-0 실크 봉합사를 사용하여 두피 절개를 닫습니다. 그런 다음 스크러프에 피하 주입하여 사이클로스포린 A킬로그램당 10밀리그램을 전달하고 마우스를 완전한 회복까지 모니터링할 수 있는 깨끗한 사전 데운 수술 후 케이지에 넣습니다. 크레니절제술 후 약 24시간 후에 마우스를 다시 스테레오탁틱 프레임에 넣습니다.
회향 수술 커튼으로 마우스를 덮습니다. 멸균 식염수로 절개 부위를 세척하여 사이트를 청소하고 봉합사를 풀어주세요. 70% 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 절개 부위를 부드럽게 살균하고 미세핀셋과 안과 가위를 사용하여 봉합사를 제거하십시오.
그런 다음 풍부한 멸균 식염수로 수술과 크레니 절제술 부위를 관개합니다. 세포 배양 생물 안전 후드에서, 부드럽게 소용돌이 또는 균질 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포의 튜브를 누릅니다. 마이크로피펫을 사용하여 플런저 끝을 통해 약 7.5 마이크로리터의 셀을 해밀턴 주사기에 적재합니다.
플런저 끝이 아래로 향하고 있는 120도 각도로 주사기를 잡고, 서스펜션과 플런저 팁 사이에 기포를 도입하지 않도록 주의하여 플런저를 삽입합니다. 개스킷 어셈블리를 파이펫 바늘에 부착하고 바늘을 주사기에 부착합니다. 플런저를 밀어 세포 서스펜션을 파이펫 바늘로 이동하고 주사기를 스테레오탁스 주사기 펌프에 부착합니다.
주사 펌프 조립이 제대로 작동하는지 확인하기 위해 플런저를 진행하고 주사를 위한 좌표로 바늘을 이동합니다. 바늘 끝을 bregma에 정렬하고 x 및 y 좌표를 0으로 설정합니다. 두개골 위에 바늘 끝을 2 밀리미터 측면으로 이동하고 1 밀리미터 후방을 뺀 후면을 bregma로 이동하고 바늘 끝을 dura mater 표면에 만드시면 됩니다.
바늘을 약간 올린 다음 바늘이 접촉한 위치에서 두라 마터에 작은 절개를 합니다. 스테레오탁좌를 0과 같도록 설정하고 플런저를 밀어 세포 현탁액이 뇌에 바늘을 도입하기 전에 적절하게 흐르는지 확인합니다. 깊은 피질의 회색 물질 /백색 물질 경계에 접목을 배치하기 위해 영하 1.4 밀리미터와 동일한 z의 깊이에 뇌에 바늘을 소개합니다.
주사기 펌프를 시작하여 15분 동안 셀 서스펜션을 주입합니다. 긴 작업 거리 현미경을 사용하여 세포 수분을 유지하기 위해 주입 중에 멸균 식염수로 수술 부위를 관개하는 세포 현탁액 유출을 모니터링합니다. 모든 세포가 전달되면 천천히 이식 바늘을 철회하고 새로운 봉합사와 절개를 닫기 전에 추가 식염수로 수술 부위를 관개하십시오.
그런 다음 입증 된 대로 수술 후 치료를 제공합니다. 접착제 테이프 제거 테스트를 위해 먼저 작은 면도기 칼을 사용하여 노란색과 빨간색 전기 테이프 조각을 부드러운 유리 표면에 3 mm 5mm 스트립으로 자른다. 시험 전에 적어도 30분 동안 마우스를 행동 시험실로 가져와서 핸들링 천을 사용하여 마우스가 몸과 머리에서 포장을 멀리 붙일 수 있도록 목과 뒷면의 스크러프에 의해 마우스를 억제합니다.
핀셋을 사용하여 각 포완의 발바닥 표면에 접착제 스트립을 배치하고 섬세하고 일관된 손가락 압력을 사용하여 스트립을 발에 고정시하십시오. 마우스를 플라스틱 실린더에 빠르게 넣고 마우스에 플라스틱 테스트 상자에 네 개의 발이 모두 있을 때 두 개의 스톱워치를 시작합니다. 그런 다음 두 개의 스톱워치를 사용하여 왼쪽 발 알림, 왼쪽 발 제거, 오른쪽 발 알림 및 오른쪽 발 제거에 대한 대기 시간을 기록합니다.
이 파일럿 실험에서, 앞다리 기능은 광신도, 제어 된 피질 충격 손상 및 순진한 마우스에서 비교되었다. 수술을 받은 마우스는 수술 직후 1~3일 동안 접착제 자극을 통지하기 위해 일시적인 증가 지연 을 나타내고 수술 후 일시적인 결핍을 눈금포에서 제거하였다. 그러나, 통제된 피질 충격을 겪은 마우스는 수술 후 28일에서 순진한 마우스에 비해 부상에 대한 전경 에 대한 모터 성능에 상당한 적자를 나타냈다.
인간 핵 항원에 대한 마우스 뇌 섹션의 면역 염색은 인간의 세포 이식이 SHAM 손상 및 제어 된 피질 영향 뇌의 호스트 조직과 명확하게 구별 될 수 있음을 보여줍니다. 배양된 인간 세포를 취급할 때 그리고 설치류 또는 면역 억제약과 접촉하는 주사기 바늘을 취급할 때 표준 실험실 안전 절차를 관찰해야 합니다. 뇌 조직 섹션은 이식편이 숙주 조직 상해 반응에 어떻게 영향을 미치는지 아는 것이 중요하기 때문에 신경 염증 성 마커의 발현을 위해 분석 될 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
우리는 부상 후 행동 결과에 미묘한 섹스 차이를 발견 놀랐다. 우리는 지금 성이 두뇌 상해에 신경 면역 반응에 있는 역할을 하는지 여부를 조사하고 있습니다. 꾸준한 손, 인내, 연습은 좋은 두개골 절제술 기술을 개발하는 데 중요합니다.
부적절한 craniectomy에서 부수적 인 손상은 세포 이식을 목표로하려는 영역을 손상시킬 수 있습니다.
