بروتوكولنا يسمح لنا بتصور كيف تستجيب الخلايا الموسومة الفلورية إلى التحفيز المحيطي الالتهابي في حي في الوقت الحقيقي. 2-Photon التصوير يسمح التصور في عمق أنسجة العينة الحية، والحفاظ على سلامة خلاياها و البيئة الدقيقة وتوفير تمثيل دقيق للنظام البيولوجي. التنفس يتحرك مخلب مع مرور الوقت، مما تسبب في ضبابية وفقدان الطائرة المحورية.
تأكد من لصق الكفب بقوة مع الشريط على سطح مستقر قبل التصوير. في هذا يجب أن تكون قادرة على العثور على الطائرة المناسبة من الفائدة، تأكد من أن الهدف هو قريب من مخلب دون لمس مباشرة فوق موقع الحقن. قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل نظام متعدد الفوتون وحدد 25X ذاتي.
ضع جهازًا مجسمًا على خشبة المجهر متعدد الفوتونات، و صل الجهاز بجهاز توصيل التخدير. ضع قطعة من الورق الأسود غير اللامع على سطح الجهاز كنقطة اتصال لمخلب الماوس. تعيين الماسح الضوئي الرنين مع منطقة مسح ثابتة من 512 من قبل 512 ميكرومتر.
ضبط أشعة الليزر الإثارة إلى 930 و 1، 100 نانومتر موجات الإثارة لإشارات البروتين الفلورسنت الخضراء والأحمر على التوالي. استخدام مرآة dichroic من 690 إلى 1، 050 نانومتر لتوجيه مسار الضوء من كل من الليزر الإثارة إلى هدف واحد يسمح ليزر الإثارة 930 نان ضبطها أن تنعكس على الماسح الضوئي الرئيسي و1، 100 نانومتر ضبطها الليزر لتمرير مباشرة إلى الماسح الضوئي الرئيسي. ثم تعيين قوة الليزر من FITC إلى 5٪ والبروتين الفلورسنت الأخضر إلى 20٪، وإيقاف الأضواء العلوية.
لفي التصوير في الجسم الحي، تخدير الماوس والموجزة في بروتوكول النص. تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في الماوس مخدر ووضع الماوس في جهاز stereotaxic مع الوصول إلى مخروط الأنف. استخدام الشريط الأسود للصق بقوة مخلب الخلفي إلى قطعة من الورق الأسود على مناطق على حد سواء القريبة وفص إلى منطقة الاهتمام، والتأكد من سطح plantar من مخلب هو دون عائق وتواجه حتى نحو الهدف.
ضع كمية سخية من مواد التشحيم القائمة على المياه على سطح اللوح من مخلب. لمس الهدف إلى مواد التشحيم لإنشاء عمود من السائل بين مخلب والهدف. استخدام الضوء الإثارة فيتC للتركيز في طبقة الجلد من مخلب، مؤكدا أن العتمة الطماطم جنبا إلى جنب الموسومة الخلايا الليفية يمكن تصور.
صورة منطقة الخلايا الموجودة تحت سطح اللوح الخلفي للمخلب الخلفي مع كل من الليزر. الحصول على فترة زمنية مدتها 15 دقيقة من حوالي 5 إلى 10 شرائح من Z في ما يقرب من ميكرومتر واحد لكل شريحة لإنشاء تمثيل أساسي للبيئة. عندما تم الحصول على التصوير الأساسي ، قم بتحميل حقنة هاملتون الزجاجية 25 ميكرولتر مع خمسة ميكروغرام من السكاريد الدهني المترافقة مع FITC ، أو LPS ، لكل 20 ميكرولترات من PBS.
إدارة الحل عن طريق الحقن داخل بلانتانار في مخلب هند التجريبية دون إزعاج موقف مخلب. ثم صورة منطقة من الخلايا الموجودة تحت سطح plantar من مخلب الخلفي مع كل من الليزر. الحصول على 60 إلى 120 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي خمسة إلى 10 ز-شرائح في ما يقرب من ميكرومتر واحد لكل شريحة لتحديد امتصاص داخل زرع الخلية بوساطة LPS FITC.
كما لا يوجد الفلورانس المتأصلة من قبل الخلايا داخل طبقة الجلد، وعدد لا يحصى من الخلايا في طبقة الجلد من مخلب هند يمكن ملاحظتها أخذ LPS الموسومة الفلورسنت بعد حقن داخل بلانتانار في نوع الماوس البرية. بعد حقن LPS FITC، فقط الليفية بروتين معين واحد الخلايا الليفية الإيجابية التي تعبر عن حصيلة مثل مستقبلات أربعة ربط وامتصاص البروتين حقن مع مستوى عال من التعريب المشترك مع علامة الطماطم الخافتة جنبا إلى جنب التي عبرت عنها هذه الخلايا. في المقابل، الفئران التي لديها حصيلة مثل مستقبلات أربعة خرج من الجسم كله لا ربط وامتصاص LPS بعد الحقن.
في الواقع، تظهر الصور الظلية الخلية بعد حقن LPS FITC مما يشير إلى أن المخدرات تتشتت في السائل الخلالي حول الخلايا، ولكن لا يتم في الواقع ملزمة من قبل مستقبلات. أهم شيء يجب تذكره في هذا البروتوكول هو التأكد من أن مخلب شلت بحيث لا توجد تشوهات في الفيديو بسبب الحركة أو التنفس. باستخدام هذا الإجراء، يمكن تتبع تجنيد الخلايا الموسومة بالفلورسنت في منطقة ما بعد الإصابة والتغيرات المورفولوجية في استجابة الخلية للمحفزات بمرور الوقت.
لذلك يسمح التصوير 2-Photon للباحثين بالجمع بين فئران المراسلات الجينية والمركبات الموسومة بالفلورسنت لتقييم ما يحدث في الحيوان الحي بعد الحقن.
