هذا البروتوكول ذو صلة خاصة لأنه يسمح الكشف عن واختيار خلايا مفردة من تجمع الخلايا المختلطة لتحليل المصب اللاحقة في دقة خلية واحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية فصل الخلايا السرطانية المنتشرة الفردية ، أو CTCs ، من خلايا الدم لمجموعة من التحليلات التي تتطلب نقاء عاليًا. تبدأ من خلال بدء تشغيل البرمجيات micromanipulator والتحول على micromanipulator.
قم بتوصيل ميكرومانبولاتور بالكمبيوتر وانقر فوق الاتصال و تهيئة الجهاز لتهيئة الذراع الروبوتية في مرحلة المجهر. تنظيف الأسطح الخارجية والداخلية من مجلس الوزراء واقية مع الإيثانول وإغلاق مجلس الوزراء واقية بعد كل التلاعب من الجهاز لتكون قادرة على المناورة الجهاز من خلال الكمبيوتر. تثبيت جديد 20 إلى 30 ميكرومتر الزجاج الشعري على الذراع الروبوتية وتدفق النفط النظام من خلال النظام لإزالة أي فقاعات في الأنابيب.
ملء خزان التعقيم واحد مع 70٪ الإيثانول، خزان التعقيم اثنين مع المياه العقيمة خالية من النوى، وخزان عازلة مع برنامج تلفزيوني Dulbecco العقيمة. تعقيم الشعيرات الدموية مرتين مع 70٪ الإيثانول واستبدال خزان التعقيم واحد مع خزان التعقيم اثنين لاستخدام وظيفة التعقيم لغسل الشعيرات الدموية في الماء ثلاث مرات على الأقل. في برنامج ميكرومانبولاتور، ابدأ تجربة جديدة وحدد نوع تجربة الانتقاء من أوضاع الاختيار التلقائية واليدوية.
تكوين علبة سطح السفينة لتحديد مواقع خزان التعقيم، خزان العازلة، وعلبة الودائع، وتعيين درجة حرارة الخزانات السائلة في علبة الإيداع المحددة إلى أربع درجات مئوية. ضع لوحة مرفق منخفضة للغاية تحتوي على حل CTC الذي تم إصداره تحت المجهر داخل الخزانة الدقيقة. إزالة الغطاء من لوحة وإغلاق خزانة.
أجهزة الطرد المركزي لوحة 384 جيدا تحتوي على 20 ميكرولترات من مركز مكافحة الإرهاب ثقافة المتوسطة في بئر لضمان أن يتم عزل المتوسطة في الجزء السفلي من كل بئر ووضع لوحة في موقف واحد الهدف من أربع درجات مئوية حاوية الإيداع المختارة. حدد يدويا الهدف المجهر لالتقاط ووقت التعرض لجميع القنوات اللازمة. حدد إظهار جيدا المستكشف لتصور وتحديد نوع لوحة بيك اب.
ثم معايرة وضعية البيك اب في وسط البئر الذي يحتوي على حل CTC بدون خلايا في وسط مجال الرؤية. استخدم المستشعر للمس الجزء السفلي من اللوحة بلطف باستخدام شعرية، ثم قم بتعيين موضع البيك اب إلى 0.05 ملليمتر فوق الجزء السفلي من اللوحة. قم بخفض الذراع الروبوتية بعناية بمقدار 10 ميكرومتر في كل مرة لتجنب إتلاف الشعيرات الدموية.
حدد نوع الخلية ومعلمات الانتقاء. بالنسبة لانتقاء الخلايا المفردة، حدد الوضع اليدوي. استخدام عصا التحكم للتنقل في الشعيرات الدموية الزجاجية داخل البئر ووضع شعري على رأس خلية واحدة من الفائدة على الأقل ملليمتر واحد من الحدود البئر.
ثم إضافة الجزيئات يدويا وحدد اختيار الجسيمات المنشط لبدء الانتقاء. عندما تم انتقاؤها جميع الخلايا، الطرد المركزي لوحة لرواسب الخلايا في الجزء السفلي من كل بئر. Bio-Amino تلطيخ مع المضادة المضادة جزيء التصاق الخلايا المضادة المضادة الظهارية يسمح التصور من الخلايا السرطانية في التعليق مع تمييز دقيق من الأحداث الإيجابية CD45.
تتميز العزلة الدقيقة لـ CTC بتطلّع الهدف المرغوب فقط دون الخلايا الملوثة المحيطة. وكما يشتبه في ذلك، فإن مجموعات لجنة مكافحة الإرهاب تظهر زيادة في البقاء مقارنة بـ "نكسات مكافحة الإرهاب" الأحادية، مما يؤدي إلى إنشاء مستعمرات خلايا في غضون 56 يوماً من الثقافة المختبرية. والجدير بالذكر أن مجموعات مكافحة الإرهاب تظهر أيضاً معدل انتشار أعلى، وبالتالي تصل إلى أرقام الخلايا النهائية الأعلى، مما يشير إلى أن الاتصال المباشر مع الخلايا السرطانية الأخرى له تأثير على قابلية الخلايا السرطانية للحياة ومعدل الانتشار.
يكشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من CTCs المعزولة مباشرة عن مرضى سرطان الثدي عن جارة عشوائية موزعة T من الخلايا المفردة المشتقة من CTCs واحدة أو مجموعات CTC أو مجموعات خلايا الدم البيضاء CTC. تذكر لتثبيت الشعيرات الدموية الزجاجية لإزالة فقاعات الهواء داخل النظام المائع من micromanipulator ومعايرة موقف بيك اب لضمان كفاءة قطف خلية واحدة. يمكن أن تكون الخلايا المفردة مبذرة أو معالجة أخرى لتسلسل الجيل التالي لتمكين تحليل vivo السابق وتوصيف CTC بدقة خلية واحدة للتحقيق في العملية النقيلية.
