Bu protokol, tek bir hücre çözümünde sonraki downstream çözümlemesi için karışık hücre havuzundan tek hücrelerin algılanmasına ve seçilmesine olanak sağladığından özellikle alakalıdır. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek saflık gerektiren bir dizi analiz için kan hücrelerinden bireysel dolaşan tümör hücreleri veya CTCs ayırmak için potansiyeldir. Mikromanipülatör yazılımını başlatarak ve mikromanipülörü açarak başlayın.
Mikromanipülörü bilgisayara bağlayın ve mikroskop aşamasındaki robot kolunu devreye almak için Connect and Initialize Device'ı tıklatın. Cihazın bilgisayar aracılığıyla manevra yapabilmesi için koruyucu kabinin dış ve iç yüzeylerini etanol ile temizleyin ve makinenin her manipülasyonundan sonra koruyucu kabini kapatın. Tüpteki kabarcıkları gidermek için robot koluna 20 ila 30 mikrometrelik yeni bir cam kılcal damar tonu ve floş sistemi yağı sistem üzerinden yükleyin.
Sterilizasyon tankını %70 etanol, steril çekirdeksiz su ile sterilizasyon tankı iki ve steril Dulbecco'nun PBS ile tampon tankı doldurun. Kılcal damarı %70 etanol ile iki kez sterilize edin ve terlizasyon tankını iki kez sterilizasyon tankı ile değiştirin ve kılcal damarı en az üç kez suda yıkayın için sterilizasyon işlevini kullanın. Mikromanipülatör yazılımında, yeni bir deneme başlatın ve otomatik ve manuel seçim modlarından toplama denemesini seçin.
Sterilizasyon tankının, tampon tankının ve biriktirme tepsisinin konumlarını belirtecek şekilde güverte tepsisini yapılandırın ve seçilen depotepsisindeki sıvı tankların sıcaklığını dört dereceye ayarlayın. Serbest bırakılan CTC çözeltisini içeren ultra düşük bir ek plakayı mikromanipülatör dolabının içine mikroskop altına yerleştirin. Kapağı tabaktan çıkarın ve dolabı kapatın.
Ortamın her kuyunun alt kısmında ele geçirilmesini sağlamak için her kuyuda 20 mikrolitre CTC kültür ortamı içeren 384 kuyuluk bir plakayı önplanda tonulayın ve plakayı dört derece santigrat derece seçilmiş mevduat tepsisinin hedef konumuna yerleştirin. Gerekli tüm kanalların çekme ve maruz kalma süresini manuel olarak seçin. İşleme yapmak ve pikap plakasının türünü seçmek için Iyi Gezinmeyi Göster'i seçin.
Daha sonra, görüş alanının merkezinde hücreler olmadan CTC çözeltisi içeren kuyunun ortasında bir toplama pozisyonu kalibre edin. Sensörü kullanarak kapillerile plakanın altına hafifçe dokunun ve pikap pozisyonunu plakanın alt kısmından 0,05 milimetre yüksekte ayarlayın. Kılcal damarlara zarar vermemek için robot kolunu bir seferde 10 mikrometre dikkatlice indirin.
Hücre türünü ve çekme parametrelerini seçin. Tek hücreli çekme için manuel modu seçin. Kuyu içinde cam kılcal gezinmek ve kuyu sınırından en az bir milimetre ilgi tek bir hücreüstüne kılcal yerleştirin joystick kullanın.
Ardından el ile parçacıklar ekleyin ve toplamayı başlatmak için Aktif Parçacıkları Seç'i seçin. Tüm hücreler toplandığında, her kuyunun altındaki hücreleri tortulamak için plakayı santrifüj edin. Anti-epitel hücre adezyon molekülü antikor ile biyo-amino boyama CD45 olumlu olaylardan doğru bir ayrım ile süspansiyon kanser hücrelerinin görüntülenmesi sağlar.
Hassas CTC izolasyonçevreleyen kirletici hücreler olmadan sadece istenilen hedefin aspirasyonu ile karakterizedir. Şüphelenildikçe, CTC kümeleri tek CtC'lere göre sağkalımda artış gösterir ve in-vitro kültürün 56 gün içinde hücre kolonilerine yol açar. Özellikle, CTC kümeleri de daha yüksek bir proliferasyon oranı sergiler ve böylece daha yüksek nihai hücre numaralarıulaşmak, diğer tümör hücreleri ile doğrudan temas tümör hücre canlılığı ve çoğalma oranı hem de bir etkisi olduğunu gösteren.
Doğrudan meme kanseri hastalarından izole CTCs tek hücreli RNA dizilimi tek CTCs türetilen tek hücreli bir T-distributed stochastic komşu gömme ortaya koymaktadır, CTC kümeleri, veya CTC beyaz kan hücresi kümeleri. Mikromanipülatörün akışkan sistemi içindeki hava kabarcıklarını çıkarmak ve verimli bir tek hücreli toplama sağlamak için toplama pozisyonunu kalibre etmek için cam kılcal damarı kurmayı unutmayın. Tek hücreli hücreler, metastatik süreci araştırmak için tek hücreli çözünürlükte ex-vivo analizi ve CTC karakterizasyonu sağlamak için yeni nesil sıralama için tohumlanabilir veya daha fazla işlenebilir.
