من بين العديد من البروتوكولات الحالية لإعداد الأنسجة للمجهر الإلكترون انتقال، اخترنا الطرق التي تسفر عن الحفاظ الهيكلي الأمثل والميكروفات الدقيقة عالية الدقة لإجراء تحليل morphometric لتوزيع الهدبيات متشابك في المحطات presynaptic. الصور عالية التباين التي تم الحصول عليها مع هذه الطرق تسمح لتحديد المعلمات مثل المسافة من حويصلات متشابك من عدد الغشاء presynaptic من حويصلات رست في الغشاء بريسينابتيك والمسافات بين حويصلات. كل هذه المعلمات تدل على الدالة متشابك.
منذ التعديلات في التنظيم المكاني من حويصلات متشابك قد تكون مرتبطة مع تعطيل وظيفة متشابك، وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة آثار التخدير العام على التنمية متشابك. ويمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لدراسة آثار أي دواء أو علاج على مورفولوجيا مفصلة من نقاط الاشتباك العصبي لتوفير نظرة ثاقبة في وظيفتها. تبدأ من خلال إعداد تتروكسيد الأوزميوم لتثبيت ما بعد أقسام الدماغ الفئران ثابتة سابقا مع paraformaldehyde وغلوتارالدهيد عن طريق الضخ الوعائي.
تصبح المقاطع جامدة بعد العلاج مع تتروكسيد أوزميوم. لذلك يتطلب التعامل مع الأنسجة الانتباه من ذلك الحين فصاعدا. أيضا، قبل إضافة osmium، تأكد من أن يتم تسوية المقاطع الخاصة بك كما أن أي أضعاف من المرجح أن يؤدي إلى كسر الأنسجة.
فتح واحد خمسة ملليلتر كوب أمبول من 4٪ أوسميوم تيتراوكسيد والماء وإسقاطه داخل زجاجة بنية. إضافة خمسة ملليلتر من 0.2 عازلة فوسفات المولر ثم إضافة 10 ملليلتر إضافية من 0.1 عازل فوسفات المولر لتحقيق حل نهائي 1٪. استخدام حقنة 20 ملليلتر مزودة بإبرة طويلة لرسم 1٪ أوزميوم تتروكسيد ومن ثم إضافة التيتروكسيد الأوزميوم إلى جرة زجاجية بنية مغطاة برقائق الألومنيوم.
بعد التأكد من أن العينة قد تكشفت وسويت، إضافة 1٪ أوسميوم تتروكسيد و0.1 PB المول إلى قارورة العينة. احتضان العينة في تتروكسيد أوسميوم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخراج تتروكسيد أوزميوم مع micropipet بعد الانتهاء من الحضانة وشطف المقاطع كما هو موضح في البروتوكول.
لإعداد خلات uranyl، ضع قارورة زجاجية حجمية 200 ملليلتر تحتوي على 100 ملليلتر من 70٪ الإيثانول على لوحة مثيرة. إضافة أربعة غرامات من خلات أورانيل إلى القارورة، والتفاف رقائق الألومنيوم لمنع هطول الأمطار عن طريق الضوء ويحرك باستمرار. يجفف الأقسام في 50٪ من الإيثانول.
وصمة عار مع إعداد 4٪ خلات أورانيل لمدة ساعة واحدة واتبع مع الجفاف التسلسلي والشطف كما هو موضح في المخطوطة. إزالة المكبس حقنة من حقنة 60 ملليلتر gavage وقبعة مع إبرة السلامة. ضع الحقنة مع الجانب المفتوح وإضافة كل عنصر من الراتنج مزيج واحدا تلو الآخر.
الانتهاء بإضافة 525 ميكروليترس من DMP30 مع الأنابيب. تحريك المكبس من pipet ببطء شديد كما DMP هو لزج جدا. ضع المكبس مرة أخرى في الحقنة.
عكس حقنة عدة مرات لخلط المحتويات. سيتغير اللون من الأصفر إلى العنبر. أخلي الهواء داخل الحقنة
ثم وضعه على الروك مع اهتزاز مستمر لمدة 30 دقيقة على الأقل. إضافة حجم واحد من راتنج الايبوكسي وحجم واحد من الأسيتون إلى قارورة متألق ويهز لخلط. تطبيق هذا واحد إلى راتنج واحد إلى خليط الأسيتون على قسم الأنسجة بعد شطف الأسيتون الماضي حفظ في مغطاة لتجنب تبخر الأسيتون.
إزالة واحد إلى واحد خليط من الراتنج والأسيتون بعد ساعتين إلى أربع ساعات واستبداله مع الراتنج الكامل واحتضان لمدة أربع ساعات. وضع جميع النفايات الراتنج في حاوية جمع تحت غطاء محرك السيارة البلمرة والتخلص منها في وقت لاحق. قطع قطعتين مستطيلة من واضح مادة البولي كلوروتريفلورو و مسحها مع 70٪ الإيثانول.
تقليم لهم بحيث يكون هناك ما لا يقل عن 1.5 سنتيمتر من البلاستيك خالية من الأنسجة على كل جانب من القسم، والتأكد من أن لديهم نفس العرض ولكن ارتفاع ورقة على رأس هو ما يقرب من 2/3 من الورقة السفلية. إمالة ببطء القارورة واستخدام فرشاة طلاء الجمال غرامة وملعقة صغيرة مرنة لرفع بلطف جدا العينة من القاع. ثم نقل بعناية القسم على طول جدران القارورة ونقلها إلى ورقة PCTFE السفلي.
إزالة الراتنج الزائد مع ملعقة صغيرة وتغطي بلطف العينة مع ورقة أعلى. دفع بلطف من أي فقاعات الهواء المحاصرين دون ممارسة الضغط المباشر على قسم الأنسجة والقضاء على الراتنج الزائد. استخدام قلم مقاومة المذيبات لتسمية الأوراق ووضعها في فرن في 60 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للبلمرة.
سحب بلطف بعيدا أوراق PCTFE تقع لفتحها. استخدام قلم مقاومة المذيبات لوضع علامة على جانب الورقة التي تحتوي على المقطع التمسك وسمه بالقرب من الأنسجة. استخدام لكمة القرص للحصول على عينة دائرة من القسم التأكد من أن علامة القلم هو جزء من الأنسجة لكمة.
علامة القلم سوف بصيص عندما يتم لمعان الضوء على العينة. ضع غطاء كبسولة تضمين الجانب حتى على حامل كبسولة. وضع قطرة من الراتنج على الغطاء وإدراج القرص لكمات داخل الغطاء مع قسم الأنسجة التي تواجه ما يصل.
إدراج كبسولة في الغطاء باستخدام حركة المسمار لطيف. استخدام ملاقط غرامة لفة وخفض قطعة مطبوعة سنتيمترين طويلة من ورقة التسمية في الكبسولة، والتأكد من أنها تناسبها مع انحناء الجدران الجانبية للكبسولة. صب الراتنج تضمين داخل الكبسولة، وملء ما يصل إلى حافة الكبسولة واستخدام عصا خشبية مدببة لدفع عينة الأنسجة إلى أسفل.
ضع الكبسولة في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للبليمرة. ثم الاستمرار في القطاعات والتلطيخ كما هو موضح في البروتوكول. يظهر ميكروجراف إلكترون من حفظ مرضية من بنية الخلايا العصبية الأغشية الخلوية الطبقات دون فواصل.
السيتوبلازم هو الحبيبية أخيرا ودون مساحات فارغة. الميتوكوندريا ليست منتفخة ولا تقلصت مع غشاء مزدوج خارجي الحفاظ عليها والكريستا الداخلية سليمة. الحفظ الأمثل من ultrastructure الخلايا العصبية والتفاصيل المورفولوجية الدقيقة أمر ضروري من أجل تصور vesicles متشابك وقياس بعدها عن الغشاء presynaptic.
يجب أن تكون الهوية متشابكة متميزة و اصطف بواسطة غشاء واحد غير منقطع. من أجل تسهيل تحليل morphometric لتوزيع الحفيات متشابك، يجب أن تكون الأغشية presynaptic وما بعد المينابتيك موازية في استمراريتها الحفاظ عليها. يظهر ميكروجراف إلكتروني من الحفاظ على خلل في بنية الأنسجة تشويه وكسر أغشية الخلايا العصبية ووجود مساحات خارج الخلية الموسع بشكل ملحوظ.
الميتوكوندريا تبدو منتفخة ولها تورم كريستا. في مثال آخر للحفاظ على بنية الأنسجة المعيبة ، كانت هناك مساحات فارغة بيضاء كبيرة داخل السيتوبلازم بدلاً من مادة السيتوبلازمية الحبيبية الدقيقة مع مساحات خارج الخلية الموسعة. غشاء اصطناعي كما forall من المرجح أن تنتج عن تعبئة الدهون أثناء التثبيت مع الجلوتارالدهيد.
عند العمل في الدماغ الشباب استخدام أنسجة 1 العازلة فوسفات الضرس كمذيب لجميع الحل الخاص بك بحيث يمكنك الحفاظ على التقوية أقرب ما يمكن إلى أن من الدماغ الفئران حديثي الولادة وتقليل انكماش الأنسجة الأثرية أو تورم. يمكن استخدام الميكروفوغرافات الدقيقة التي تم الحصول عليها بهذه الطرق لدراسة المورفولوجيا التفصيلية والعلاقات الهيكلية الأبعاد لعدد من المكونات الخلوية بخلاف الحووية المتشابكة. على سبيل المثال، الميتوكوندريا، جهاز غولجي والكروماتين النووية.
تتطلب عدة خطوات في هذا البروتوكول مواد كيميائية يمكن أن تكون سامة. دائماً العمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع الألدهيدات، أوسميوم، اليورانيوم ومركبات الرصاص.
