نشكر شاو مينغ وليو هاريس Gelbard ألف لاستخدام مضخة تمعجية وvibratome ، وكذلك كارين L. بنتلي وغايل شنايدر في مرفق مجهر إلكترون الأساسية للبحوث التابع لجامعة روتشستر المركز الطبي لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، بوروز صندوق ويلكوم ، وألفريد سلون P. المؤسسة لبأنقرة. M.-È.T. وتمول من قبل دي فون LA RECHERCHE EN كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب.

1. الحيوان نضح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم التروية ، وإعداد : -- 2 لتر من الفوسفات عازلة (PB و 100 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) و 1 لتر من الصوديوم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم في الجريدة الرسمية ، 50 مم ، ودرجة الحموضة 7.4) في الماء المقطر مزدوجة. تخزين برنامج تلفزيوني و1L من PB في 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم هذه لنضح وكيمياء سيتولوجية مناعية قبل التضمين. -- 1L بارافورمالدهيد من 4.0 ٪ (منهاج العمل ، ودرجة الحموضة 7.4) حل تثبيتي ، والتي ستمكن نضح من 6 الفئران. لهذا الغرض ، تسخين 1 لتر من PB تحت غطاء الدخان. تزن 40 غراما من بارافورمالدهيد الحبيبية (PFA) وتصب في حل PB عندما يصل إلى 60 درجة مئوية. عندما حل واضح ، مع PFA حله تماما ، بارد لدرجة حرارة الغرفة (RT) وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم التروية ، وإعداد 500 مل من محلول 3.5 ٪ في الأكرولين PB تحت غطاء الدخان. ثم ، تصفية الأكرولين 3.5 ٪ و 4.0 ٪ حلول PFA استعمال ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس للتخدير ، وضخ بنتوباربيتال الصوديوم (80 ملغ / كلغ) في الصفاق مع قياس 27 ½ &quot;إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال التروية ، و 50 مل من برنامج تلفزيوني ، سيكون 75 مل من الأكرولين ، و 150 مل من PFA تمرير بالتسلسل إلى الدورة الدموية الماوس. لاقامة مضخة تمعجية ، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مقياس 23 ¾ &quot;فراشة إبرة في نهاية واحدة. تزج الطرف الآخر من الأنبوب إلى حل التروية (PBS ، أو الأكرولين PFA). تعيين سرعة تمعجية مضخة ل20-25 مل / دقيقة بالنسبة للفئران الأحداث والبالغين. طوال التروية ، وتجنب بعناية أي فقاعات من الهواء يتشكل في الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حتى الماوس مخدرة لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل قرصة الذيل ، وقبل المضي قدما. وضع الحيوانات في علبة تشريح وتحديد الكفوف باستخدام الشريط. مع ملاقط ومقصات ، وتفتح البشرة وتجويف الصدر للكشف عن القلب. للحد من نقص تروية الدماغ ، ونضح يحتاج إلى أن تبدأ بسرعة. خفض فتح الأذين الأيمن مع مقص صغير وبدء ضخ تمعجية. في حين عقد القلب مع ملاقط ، تضاف إبرة فراشة في قمة البطين الأيسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تغيير الحل ، ووقف ضخ تمعجية ، ونقل الأنبوب من حل واحد لآخر ، وإعادة تشغيل المضخة على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند 150 مل PFA مرت ، ووقف ضخ تمعجية. باستخدام مقص صغير ، وقطع رأسه ، وفتح الجلد ، وكسر في الجمجمة بين العينين. استخدام ملاقط صغيرة ، ورقاقة بعناية قطع صغيرة من الجمجمة حتى يمكن إزالتها بسهولة الدماغ. بعد إصلاح الدماغ لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية في منهاج العمل. تغسل 3 مرات في 10 دقيقة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على الفور في الدماغ عرضية (50 ميكرون سميكة المقاطع) في جليد تبريد PBS باستخدام vibratome. بفرشاة غرامة ، ونقل المقاطع المختارة للكيمياء سيتولوجية مناعية في قارورة زجاجية تحتوي على برنامج تلفزيوني. تخزين المقاطع المتبقية في -20 درجة مئوية في cryoprotectant (30 ٪ جلايكول الإثيلين والجلسرين بنسبة 30 ٪ في PBS) لمدة تصل إلى عدة سنوات. </li></ol> 2. قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكيمياء سيتولوجية مناعية ، تتم معالجة أقسام عائمة بحرية في قوارير زجاجية. في جميع أنحاء الداخلي ، ويحتاج المرء لتجنب بعناية السماح المقاطع تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة نقل واستبدالها فورا بمحلول جديدة من بوروهيدريد الصوديوم 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة ، وإزالة جميع فقاعات ، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT في محلول يحتوي على حجب PBS 0.5 ٪ الجيلاتين والمصل العادي 5 ٪ من الحيوانات في جسم الثانوية التي ولدت (مصل طبيعي في الماعز على سبيل المثال الحالي immunostaining - Iba1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 48 ساعة مع الضد الرئيسي في عرقلة الحل. لimmunostaining - Iba1 ، استخدم أرنب المضادة للIba1 الأضداد (1:1000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة واحتضان الضد في الثانوية مترافق لالبيوتين (1:1000) في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة على RT. لimmunostaining - Iba1 ، واستخدام الماعز المضادة للأرنب الجماعات الحكومية الدولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة في احتضان وstreptavidin - الفجل البيروكسيداز (1:1000) في عرقلة الحل : 1 ساعة بمعدل RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني وتريس / حمض الهيدروكلوريك ، مخزنة المالحة (TBS و 50 مم ، درجة الحموضة 7.4) 2 مرات 10 دقيقة. لتكشف عن وضع العلامات ، واحتضان المقاطع مع DAB 0.05 ٪ و 0.01 ٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS (حل الطازجة). عندما تلطيخ هو اللون البني الغامق (انظر المثال في الشكل 1) ، والتوقف عن رد الفعل من قبل الشطف في TBS. في أي حال ، رد الفعل بعد نهاية مدة أقصاها 5 دقائق. شطف المقاطع مع 10 دقيقة مع وTBS PB 2 مرات 10 دقائق. </li></ol> 3. التجهيز للفحص المجهري الإلكترون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع في الجريدة الرسمية في لوحة الثقافة multiwell باستخدام فرشاة دقيقة. إعداد 1 ٪ حل رباعي أكسيد الأوزميوم في الجريدة الرسمية تحت غطاء دخن. إزالة PB من الآبار من لوحة والثقافة<html> نشر مقاطع شقة بفرشاة دقيقة. تزج فورا المقاطع في الأوزميوم 1 ٪ لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع في قوارير الزجاج ، وشطف مع PB 3 مرات 10 دقيقة ، ويذوى دقائق عن طريق الغمر 2 في الصعود تركيزات الايثانول : 2 مرات 35 ٪ ، و 1 في كل مرة من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 95 ٪ ، و 3 مرات 100 ٪ ، تليها 3 مرات أكسيد البروبيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد Durcupan الراتنج ، والجمع بين 20 غراما من العنصر A ، B 20 غراما من العنصر ، و 0.6 غرام من المكون جيم ، و 0.4 غرام من عنصر دال في دورق المتاح ، وتخلط جيدا حتى يصبح لون موحد ، وتصب من الألمنيوم تزن الطبق. إذا لزم الأمر ، يمكن أن تكون على استعداد كتل الراتنج الراتنج بصب قوالب والتضمين في علاج 55 في فرن درجة مئوية ل48-72 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة مع غرامة تشطف أكسيد البروبيلين ، وإزالة المقاطع من أكسيد البروبيلين وتزج في الراتنج Durcupan ليلة وضحاها في التشريب RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وضعت في صحن الألمنيوم تزن فرن 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتليين الراتنج. باستخدام فرشاة تشطف مع أكسيد البروبيلين ، ومعطف فيلم تضمين ACLAR بطبقة رقيقة من الراتنج ، والقاء المقاطع ، وتغطي مع فيلم آخر التضمين ، وتوزيعها بالتساوي الأوزان الخفيفة (حوالي 2 غرام ، على سبيل المثال أغطية بلاستيكية من قوارير الزجاج) على رأس لمساعدة الراتنج الانتشار. لبلمرة الراتنج ، واحتضان في الفرن لمدة 48-72 ساعة (عند درجة حرارة 55 مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد البلمرة ، إزالة الأوزان الخفيفة وتضمين الفيلم في الجزء العلوي من الأبواب. تحت المجهر مجهر ، حدد مربع من المناطق الفائدة (حوالي ملم 2x2) من المكوس وبعناية من الفيلم باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء في المجالات ذات الاهتمام على طرف باستخدام كتل الراتنج Superglue والعلاج في الفرن 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لsectioning ، وتقليم كتلة راتنج على شكل شبه منحرف متساوي الساقين لبشفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشراح مستدق باستخدام سكين والزجاج ، وإزالة الصمغ والراتنج على سطح النسيج. ملء القارب من السكين والزجاج المزدوج مع الماء المقطر وخفض عدد قليل من شبه رقيقة المقاطع (0.5-1 ميكرومتر سميكة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع إلى شريحة SuperFrost مع حلقة الكمال. الجافة المقاطع من خلال وضع الشريحة على لوحة التدفئة بنسبة 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. غلاف مع بضع قطرات من 0.1 ٪ طولويدين الزرقاء وصمة عار (2 بورات الصوديوم و 0.2 ز ز طولويدين الزرقاء في 200 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 1 دقيقة. شطف الزائدة وصمة عار مع الماء المقطر مزدوجة. وفحص الأجزاء مع مجهر ضوء تمكين لتمييز الأنسجة الملون من الراتنج (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف قطع حتى الحدود بين الأنسجة والراتنج يصل إلى منتصف المقاطع. نلاحظ أن الإجراء التالي يتطلب التدريب. استبدال الزجاج سكين بسكين الماس وملء القارب بالماء المقطر مزدوجة. قطع الفضة الى اقسام سامسونج الفضة والذهب (60-80 نانومتر سميكة) وجمع لهم بعناية على شبكات سلكية النحاس باستخدام الملقط مقلوب الغرامة. تجفيف شبكات على ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعزيز النقيض من ذلك ، يمكن سامسونج ملطخة المقاطع مع سترات الرصاص (0.03 سترات الرصاص و 0.1 مل ز هيدروكسيد الصوديوم 10N في 10 مل من الماء المقطر المزدوج 1). باستخدام الملقط مقلوب غرامة ، وتحويل الشبكة إلى قطرة من سترات الرصاص لمدة 2 دقيقة. إزالة الشبكة وشطف بدقة في 3 حمامات متعاقبة من الماء المقطر مزدوجة. أخيرا ، تجفيف شبكات على ورقة الترشيح وتخزينها في المربع الشبكة حتى الفحص المجهري الإلكترون (الشكلان 3-6). </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. Iba1 الملطخة الباب على المستوى المجهري الخفيفة. ويقتصر توزيع الخلوي للIba1 إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على خصوصية immunostaining. مقياس بار = 100 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. طولويدين الزرقاء الملطخة شبه رقيقة المقطع على مستوى المجهرية الخفيفة. لاحظ الحدود بين الأنسجة والراتنج حيث immunostaining سيظهر على أشده في المجهر الالكتروني. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> القسم سامسونج الرقم 3. يظهر Iba1 - immunopositive حوائط النواة دبقية صغيرة والعمليات على المستوى المجهري الإلكترون. يتم التعرف على العناصر الهيكلية التي Iba1 إيجابية على يعجل الإلكترونات كثيفة immunoperoxidase - DAB. مقياس شريط = 2 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> القسم سامسونج الرقم 4. عرض Iba1 - immunopositive العمليات دبقية صغيرة من مختلف الأحجام والأشكال على المستوى المجهري الإلكترون. مقياس شريط = 2 ميكرون. ه 5 &quot;/&gt; الشكل 5. سامسونج المقطع يظهر في أعلى التكبير عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة من الشكل (4) ، مما يتيح له التعرف على عضيات داخل الخلايا. مقياس بار = 1 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. سامسونج تكشف المقطع في أعلى التكبير العلاقات التركيبية بين عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة والعناصر القريبة neuropil بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي. مقياس شريط = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هنا قد وصفنا على بروتوكول لإعداد الماوس لأنسجة المخ immunoelectron المجهري الذي يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical ، عندما يتم تنفيذها بدقة الإجراءات. جنبا إلى جنب مع تيم ، وهذه الطريقة تمكن من التمييز بين ?...

* واحد وينبغي أن تعمل دائما تحت غطاء الدخان وارتداء القفازات عند التعامل مع النتريل الأكرولين ، بارافورمالدهيد والأوزميوم وينبغي التخلص من نفاياتها أيضا صحيح.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

انتقال الإلكترون المجهر (تيم) مفيد للغاية لتصور دبقية صغيرة ، المقصورات oligodendrocytic التحت خلوية ، نجمي ، والعصبية (تغصن والعمود الفقري شجيري ، المحور ، محور عصبي عضال ، حوائط النواة) ، وكذلك على الخلايا والعضيات الهيكل الخلوي ، في الجهاز العصبي المركزي في ارتفاع القرار المكانية. جنبا إلى جنب مع تيم ، قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية يسمح للتمييز من العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية (على سبيل المثال ، دبقية perikarya والعمليات ، وعند استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة Iba1 (الكالسيوم المتأينة الجزيء محول ملزمة 1 ؛ كما عرضت هنا)) ، وتحديد محتويات العصبي من العناصر الخلوية (مثل هرمون السيروتونين) ، وتوطين هذه التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء زمنيا (على سبيل المثال ، 5 ومستقبلات HT1A EphA4). هنا ، نحن تصف بروتوكول للنضح transcardiac من الفئران مع تثبيتي الأكرولين وإزالتها وsectioning من الدماغ ، فضلا عن immunoperoxidase - diaminobenzidine تلطيخ (DAB) ، التضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning للأقسام الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد لفحص مع تيم. عندما أجريت بدقة ، وهذا الأسلوب يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K Views.  University of Rochester. وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

الجمع بين التفكك الميكانيكي والأنزيمي لأنسجة الحصين في دماغ الفئران

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

المجهر الفلوري ثلاثي الفوتون للأنسجة العميقة في دماغ الفأر وسمك الزرد السليم

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

تصوير ثنائي الفوتون والكالسيوم واسع المجال في القولون العلوي

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن الترميز العصبي وآليات المعالجة البصرية في القولون العلوي 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...