نشكر شاو مينغ وليو هاريس Gelbard ألف لاستخدام مضخة تمعجية وvibratome ، وكذلك كارين L. بنتلي وغايل شنايدر في مرفق مجهر إلكترون الأساسية للبحوث التابع لجامعة روتشستر المركز الطبي لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، بوروز صندوق ويلكوم ، وألفريد سلون P. المؤسسة لبأنقرة. M.-È.T. وتمول من قبل دي فون LA RECHERCHE EN كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب.

1. الحيوان نضح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم التروية ، وإعداد : -- 2 لتر من الفوسفات عازلة (PB و 100 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) و 1 لتر من الصوديوم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم في الجريدة الرسمية ، 50 مم ، ودرجة الحموضة 7.4) في الماء المقطر مزدوجة. تخزين برنامج تلفزيوني و1L من PB في 4 درجات مئوية. وسوف تستخدم هذه لنضح وكيمياء سيتولوجية مناعية قبل التضمين. -- 1L بارافورمالدهيد من 4.0 ٪ (منهاج العمل ، ودرجة الحموضة 7.4) حل تثبيتي ، والتي ستمكن نضح من 6 الفئران. لهذا الغرض ، تسخين 1 لتر من PB تحت غطاء الدخان. تزن 40 غراما من بارافورمالدهيد الحبيبية (PFA) وتصب في حل PB عندما يصل إلى 60 درجة مئوية. عندما حل واضح ، مع PFA حله تماما ، بارد لدرجة حرارة الغرفة (RT) وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم التروية ، وإعداد 500 مل من محلول 3.5 ٪ في الأكرولين PB تحت غطاء الدخان. ثم ، تصفية الأكرولين 3.5 ٪ و 4.0 ٪ حلول PFA استعمال ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماوس للتخدير ، وضخ بنتوباربيتال الصوديوم (80 ملغ / كلغ) في الصفاق مع قياس 27 ½ &quot;إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال التروية ، و 50 مل من برنامج تلفزيوني ، سيكون 75 مل من الأكرولين ، و 150 مل من PFA تمرير بالتسلسل إلى الدورة الدموية الماوس. لاقامة مضخة تمعجية ، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مقياس 23 ¾ &quot;فراشة إبرة في نهاية واحدة. تزج الطرف الآخر من الأنبوب إلى حل التروية (PBS ، أو الأكرولين PFA). تعيين سرعة تمعجية مضخة ل20-25 مل / دقيقة بالنسبة للفئران الأحداث والبالغين. طوال التروية ، وتجنب بعناية أي فقاعات من الهواء يتشكل في الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حتى الماوس مخدرة لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل قرصة الذيل ، وقبل المضي قدما. وضع الحيوانات في علبة تشريح وتحديد الكفوف باستخدام الشريط. مع ملاقط ومقصات ، وتفتح البشرة وتجويف الصدر للكشف عن القلب. للحد من نقص تروية الدماغ ، ونضح يحتاج إلى أن تبدأ بسرعة. خفض فتح الأذين الأيمن مع مقص صغير وبدء ضخ تمعجية. في حين عقد القلب مع ملاقط ، تضاف إبرة فراشة في قمة البطين الأيسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تغيير الحل ، ووقف ضخ تمعجية ، ونقل الأنبوب من حل واحد لآخر ، وإعادة تشغيل المضخة على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند 150 مل PFA مرت ، ووقف ضخ تمعجية. باستخدام مقص صغير ، وقطع رأسه ، وفتح الجلد ، وكسر في الجمجمة بين العينين. استخدام ملاقط صغيرة ، ورقاقة بعناية قطع صغيرة من الجمجمة حتى يمكن إزالتها بسهولة الدماغ. بعد إصلاح الدماغ لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية في منهاج العمل. تغسل 3 مرات في 10 دقيقة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على الفور في الدماغ عرضية (50 ميكرون سميكة المقاطع) في جليد تبريد PBS باستخدام vibratome. بفرشاة غرامة ، ونقل المقاطع المختارة للكيمياء سيتولوجية مناعية في قارورة زجاجية تحتوي على برنامج تلفزيوني. تخزين المقاطع المتبقية في -20 درجة مئوية في cryoprotectant (30 ٪ جلايكول الإثيلين والجلسرين بنسبة 30 ٪ في PBS) لمدة تصل إلى عدة سنوات. </li></ol> 2. قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكيمياء سيتولوجية مناعية ، تتم معالجة أقسام عائمة بحرية في قوارير زجاجية. في جميع أنحاء الداخلي ، ويحتاج المرء لتجنب بعناية السماح المقاطع تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة نقل واستبدالها فورا بمحلول جديدة من بوروهيدريد الصوديوم 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة ، وإزالة جميع فقاعات ، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT في محلول يحتوي على حجب PBS 0.5 ٪ الجيلاتين والمصل العادي 5 ٪ من الحيوانات في جسم الثانوية التي ولدت (مصل طبيعي في الماعز على سبيل المثال الحالي immunostaining - Iba1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 48 ساعة مع الضد الرئيسي في عرقلة الحل. لimmunostaining - Iba1 ، استخدم أرنب المضادة للIba1 الأضداد (1:1000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة واحتضان الضد في الثانوية مترافق لالبيوتين (1:1000) في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة على RT. لimmunostaining - Iba1 ، واستخدام الماعز المضادة للأرنب الجماعات الحكومية الدولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع أقسام PBS 3 مرات 10 دقيقة في احتضان وstreptavidin - الفجل البيروكسيداز (1:1000) في عرقلة الحل : 1 ساعة بمعدل RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع مع 10 دقائق مع برنامج تلفزيوني وتريس / حمض الهيدروكلوريك ، مخزنة المالحة (TBS و 50 مم ، درجة الحموضة 7.4) 2 مرات 10 دقيقة. لتكشف عن وضع العلامات ، واحتضان المقاطع مع DAB 0.05 ٪ و 0.01 ٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS (حل الطازجة). عندما تلطيخ هو اللون البني الغامق (انظر المثال في الشكل 1) ، والتوقف عن رد الفعل من قبل الشطف في TBS. في أي حال ، رد الفعل بعد نهاية مدة أقصاها 5 دقائق. شطف المقاطع مع 10 دقيقة مع وTBS PB 2 مرات 10 دقائق. </li></ol> 3. التجهيز للفحص المجهري الإلكترون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع في الجريدة الرسمية في لوحة الثقافة multiwell باستخدام فرشاة دقيقة. إعداد 1 ٪ حل رباعي أكسيد الأوزميوم في الجريدة الرسمية تحت غطاء دخن. إزالة PB من الآبار من لوحة والثقافة<html> نشر مقاطع شقة بفرشاة دقيقة. تزج فورا المقاطع في الأوزميوم 1 ٪ لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع في قوارير الزجاج ، وشطف مع PB 3 مرات 10 دقيقة ، ويذوى دقائق عن طريق الغمر 2 في الصعود تركيزات الايثانول : 2 مرات 35 ٪ ، و 1 في كل مرة من 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 95 ٪ ، و 3 مرات 100 ٪ ، تليها 3 مرات أكسيد البروبيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد Durcupan الراتنج ، والجمع بين 20 غراما من العنصر A ، B 20 غراما من العنصر ، و 0.6 غرام من المكون جيم ، و 0.4 غرام من عنصر دال في دورق المتاح ، وتخلط جيدا حتى يصبح لون موحد ، وتصب من الألمنيوم تزن الطبق. إذا لزم الأمر ، يمكن أن تكون على استعداد كتل الراتنج الراتنج بصب قوالب والتضمين في علاج 55 في فرن درجة مئوية ل48-72 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة مع غرامة تشطف أكسيد البروبيلين ، وإزالة المقاطع من أكسيد البروبيلين وتزج في الراتنج Durcupan ليلة وضحاها في التشريب RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وضعت في صحن الألمنيوم تزن فرن 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتليين الراتنج. باستخدام فرشاة تشطف مع أكسيد البروبيلين ، ومعطف فيلم تضمين ACLAR بطبقة رقيقة من الراتنج ، والقاء المقاطع ، وتغطي مع فيلم آخر التضمين ، وتوزيعها بالتساوي الأوزان الخفيفة (حوالي 2 غرام ، على سبيل المثال أغطية بلاستيكية من قوارير الزجاج) على رأس لمساعدة الراتنج الانتشار. لبلمرة الراتنج ، واحتضان في الفرن لمدة 48-72 ساعة (عند درجة حرارة 55 مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد البلمرة ، إزالة الأوزان الخفيفة وتضمين الفيلم في الجزء العلوي من الأبواب. تحت المجهر مجهر ، حدد مربع من المناطق الفائدة (حوالي ملم 2x2) من المكوس وبعناية من الفيلم باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء في المجالات ذات الاهتمام على طرف باستخدام كتل الراتنج Superglue والعلاج في الفرن 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لsectioning ، وتقليم كتلة راتنج على شكل شبه منحرف متساوي الساقين لبشفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشراح مستدق باستخدام سكين والزجاج ، وإزالة الصمغ والراتنج على سطح النسيج. ملء القارب من السكين والزجاج المزدوج مع الماء المقطر وخفض عدد قليل من شبه رقيقة المقاطع (0.5-1 ميكرومتر سميكة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع إلى شريحة SuperFrost مع حلقة الكمال. الجافة المقاطع من خلال وضع الشريحة على لوحة التدفئة بنسبة 80 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. غلاف مع بضع قطرات من 0.1 ٪ طولويدين الزرقاء وصمة عار (2 بورات الصوديوم و 0.2 ز ز طولويدين الزرقاء في 200 مل من الماء المقطر المزدوج) لمدة 1 دقيقة. شطف الزائدة وصمة عار مع الماء المقطر مزدوجة. وفحص الأجزاء مع مجهر ضوء تمكين لتمييز الأنسجة الملون من الراتنج (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئناف قطع حتى الحدود بين الأنسجة والراتنج يصل إلى منتصف المقاطع. نلاحظ أن الإجراء التالي يتطلب التدريب. استبدال الزجاج سكين بسكين الماس وملء القارب بالماء المقطر مزدوجة. قطع الفضة الى اقسام سامسونج الفضة والذهب (60-80 نانومتر سميكة) وجمع لهم بعناية على شبكات سلكية النحاس باستخدام الملقط مقلوب الغرامة. تجفيف شبكات على ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعزيز النقيض من ذلك ، يمكن سامسونج ملطخة المقاطع مع سترات الرصاص (0.03 سترات الرصاص و 0.1 مل ز هيدروكسيد الصوديوم 10N في 10 مل من الماء المقطر المزدوج 1). باستخدام الملقط مقلوب غرامة ، وتحويل الشبكة إلى قطرة من سترات الرصاص لمدة 2 دقيقة. إزالة الشبكة وشطف بدقة في 3 حمامات متعاقبة من الماء المقطر مزدوجة. أخيرا ، تجفيف شبكات على ورقة الترشيح وتخزينها في المربع الشبكة حتى الفحص المجهري الإلكترون (الشكلان 3-6). </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. Iba1 الملطخة الباب على المستوى المجهري الخفيفة. ويقتصر توزيع الخلوي للIba1 إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على خصوصية immunostaining. مقياس بار = 100 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. طولويدين الزرقاء الملطخة شبه رقيقة المقطع على مستوى المجهرية الخفيفة. لاحظ الحدود بين الأنسجة والراتنج حيث immunostaining سيظهر على أشده في المجهر الالكتروني. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> القسم سامسونج الرقم 3. يظهر Iba1 - immunopositive حوائط النواة دبقية صغيرة والعمليات على المستوى المجهري الإلكترون. يتم التعرف على العناصر الهيكلية التي Iba1 إيجابية على يعجل الإلكترونات كثيفة immunoperoxidase - DAB. مقياس شريط = 2 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> القسم سامسونج الرقم 4. عرض Iba1 - immunopositive العمليات دبقية صغيرة من مختلف الأحجام والأشكال على المستوى المجهري الإلكترون. مقياس شريط = 2 ميكرون. ه 5 &quot;/&gt; الشكل 5. سامسونج المقطع يظهر في أعلى التكبير عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة من الشكل (4) ، مما يتيح له التعرف على عضيات داخل الخلايا. مقياس بار = 1 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. سامسونج تكشف المقطع في أعلى التكبير العلاقات التركيبية بين عملية Iba1 إيجابية دبقية صغيرة والعناصر القريبة neuropil بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي. مقياس شريط = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هنا قد وصفنا على بروتوكول لإعداد الماوس لأنسجة المخ immunoelectron المجهري الذي يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical ، عندما يتم تنفيذها بدقة الإجراءات. جنبا إلى جنب مع تيم ، وهذه الطريقة تمكن من التمييز بين ?...

* واحد وينبغي أن تعمل دائما تحت غطاء الدخان وارتداء القفازات عند التعامل مع النتريل الأكرولين ، بارافورمالدهيد والأوزميوم وينبغي التخلص من نفاياتها أيضا صحيح.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

انتقال الإلكترون المجهر (تيم) مفيد للغاية لتصور دبقية صغيرة ، المقصورات oligodendrocytic التحت خلوية ، نجمي ، والعصبية (تغصن والعمود الفقري شجيري ، المحور ، محور عصبي عضال ، حوائط النواة) ، وكذلك على الخلايا والعضيات الهيكل الخلوي ، في الجهاز العصبي المركزي في ارتفاع القرار المكانية. جنبا إلى جنب مع تيم ، قبل تضمين كيمياء سيتولوجية مناعية يسمح للتمييز من العناصر الخلوية ذات خصائص متميزة قليلة ومعايير تحديد الهوية (على سبيل المثال ، دبقية perikarya والعمليات ، وعند استخدام الأجسام المضادة ضد علامة الخلايا الدبقية الصغيرة الخاصة Iba1 (الكالسيوم المتأينة الجزيء محول ملزمة 1 ؛ كما عرضت هنا)) ، وتحديد محتويات العصبي من العناصر الخلوية (مثل هرمون السيروتونين) ، وتوطين هذه التركيبية للبروتينات قابلة للذوبان أو الغشاء زمنيا (على سبيل المثال ، 5 ومستقبلات HT1A EphA4). هنا ، نحن تصف بروتوكول للنضح transcardiac من الفئران مع تثبيتي الأكرولين وإزالتها وsectioning من الدماغ ، فضلا عن immunoperoxidase - diaminobenzidine تلطيخ (DAB) ، التضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning للأقسام الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد لفحص مع تيم. عندما أجريت بدقة ، وهذا الأسلوب يوفر حلا وسطا بين الحفاظ ممتازة التركيبية الأمثل وكشف immunocytochemical.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K Views.  University of Rochester. وصفنا بروتوكول للنضح transcardiac إزالة والفئران وsectioning من الدماغ ، فضلا عن تلطيخ immunoperoxidase ، تضمين الراتنج ، وسامسونج sectioning من المقاطع الدماغ. عند الانتهاء من هذه الإجراءات ، والمواد immunostained مستعد للفحص المجهري مع انتقال الإلكترون.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

اعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للتحليل البنيوي الهيكلي للتوزيع الحويصلة المتشابكة في المحطات العصبية

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكترون (SBEM) لدراسة العمود الفقري Dendritic

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video