هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لنا بتصور البيئة الدقيقة حيث تنتج الخلايا سيتوكين معين، هنا، إنترفيرون غاما. ومن المسلم به أن مجموعة من عمل السيتوكينات محدودة لأن الأنسجة معقدة جدا. من المهم تحديد خصائص الخلايا التي تحيط بالخلايا المنتجة للـ(إنترفيرون جاما) لتحديد الخلايا التي سيتم تناولها.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تعطل البيئة الدقيقة الموجودة في الأنسجة ذات الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك، لأننا لا إعادة الخلايا اصطناعياً لإجبارهم على إنتاج إنترفيرون غاما، فإنه يعطينا توصيفاً أفضل لما إذا كانت الخلايا تنتج فعلياً بنشاط إنترفيرون غاما في الموقع. هذا البروتوكول يمكن أن تتكيف مع أجهزة أخرى وتصور السيتوكينات الأخرى.
معظم الخطوات في هذا البروتوكول بسيطة ، ولكن التعامل مع الأنسجة ، والتجميد والقطع ، يجب أن يتم مع الحرص على الحفاظ على سلامة الأنسجة. للبدء، نقل 300 ميكرولترات من LM مثقف وراثيا تعديلها للتعبير عن OVA إلى ضخ القلب مرق في 37 درجة مئوية في قارورة. ضع القارورة على شاكر لإثارة لطيف لتنمو LM إلى مرحلة أسية حتى تصل إلى OD600 0.08 إلى 0.1.
بعد تمييع ثقافة OVA LM في PBS إلى تركيز 0.1 مرة جرعة قاتلة ، 50 ٪ استخدام حقنة الأنسولين 29 قياس لحقن الوريدي 100 ميكرولترات في C57 الأسود 6 أنواع الحيوانات البرية الفئران المتلقين تحمل OT1 GFP أو OT1 الخلايا RFP. لمنع إفراز السيتوكين قبل 6 ساعات من تضحية الماوس ، حقن 250 ميكروغرام من BFA و 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني intraperitoneally مع حقنة الأنسولين 29 قياس. بعد القتل الرحيم من الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون والخلع عنق الرحم اللاحقة، وتطهير البطن مع 70٪الإيثانول.
على الجناح الأيسر من الفأر حيث يقع الطحال ، وقطع من خلال الجلد مع مقص لجعل شق من 1-2 سم. ثم، جعل بعناية شق في الصفاق لفضح الطحال واخراجه مع ملاقط. يجب الحرص على عدم الضغط عليه مع ملقط أو قطع عليه لتجنب تعطيل العمارة الطحال.
الآن، وإعداد الحل المثبت عن طريق خلط 3.75 ملليلتر من برنامج تلفزيوني و 3.75 ملليلتر من 0.2 مولار L-lysine. إضافة 21 ملليغرام من الصوديوم m-periodate ويخلط جيدا. ثم إضافة 2.5 ملليلتر من 4٪ PFA و 20 ميكرولترات من 12 هيدروكسيد الصوديوم العادي.
قطع الطحال إلى ثلاثة أجزاء. غمر الطحال في التثبيت في لوحة ستة بئر وإصلاح لمدة لا تقل عن أربع ساعات. فترة التثبيت النموذجية هي 16 إلى 20 ساعة في أربع درجات مئوية تحت الانفعالات لطيف.
بعد ذلك ، تجاهل الحل المثبت وإضافة خمسة ملليلتر من PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض لطيف. ثم، استبدال برنامج تلفزيوني مع خمسة ملليلتر من 30٪ السكروز واحتضان لمدة 12 إلى 24 ساعة للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. الآن، العضو يغرق في الجزء السفلي من لوحة.
لتجميد العينة، ضعي الثلج الجاف في وعاء كبير ووضع وعاء أصغر داخله يحتوي على حوالي 50 ملليلتر من الميثانول النقي وبضع قطع من الجليد الجاف. جفف الطحال بلطف على مسح خالي من الوبر. بالتنقيط قطرة من مركب أوك في الجزء السفلي من العفن قاعدة ووضع الطحال داخل القالب.
يجب الحرص على عدم إنتاج أي فقاعات. إضافة ما يقرب من ملليلتر من أكتوبر على الطحال. مع ملقط، إيداع القالب الأساسي على سطح الميثانول في حمام الجليد الجاف، والتأكد من الميثانول لا تلمس أكتوبر.
وسوف تُكدَك أوكتُن وتصبح بيضاء عندما تُجمد. تذكر أن تجميد الأنسجة بأسرع وقت ممكن لتقليل القطع الأثرية. على ميكروتوم التبريد، تعيين إلى درجة حرارة ناقص 20 درجة مئوية.
قسم الأنسجة إلى سمك المطلوب، حوالي 10 ميكرومتر. استخدم فرشاة لجمع المقاطع على شرائح المجهر الزجاجي وفحص بصريا. السماح للأبواب أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
رسم دائرة مع مانع السائل، على سبيل المثال، قلم PAP، حول قسم الأنسجة خارج أكتوبر. مرة واحدة وقد جفت الأنسجة، وإعادة هيدرات العينة عن طريق نازف 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على قسم الأنسجة لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة برنامج تلفزيوني من القسم عن طريق الطموح وإضافة 100 ميكرولترات من حظر حل لكل مقطع عينة.
احتضان في غرفة رطبة مغطاة لمدة ساعة واحدة كحد أدنى في درجة حرارة الغرفة. للصبغة مع الأجسام المضادة الأولية، استبدال حل حظر مع مزيج الأجسام المضادة الأولية المعدة لكل عينة. احتضان لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة مبللة مغطاة قبل الغسيل وفقا للمخطوطة.
الآن، تمييع الأجسام المضادة الثانوية ذات الأهمية إلى التركيز الأمثل، عادة 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر، في حل الحجب. قم بإزالة محلول الغسيل النهائي من القسم وأضف مزيج الأجسام المضادة الثانوية المعدة فوق القسم وحضن لمدة ساعة إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة مغطاة. بعد الغسيل مع عازلة غسل وفقا للمخطوطة، وإزالة محلول غسل وإجراء غسل النهائي مع برنامج تلفزيوني.
pirate المالحة الفوسفات المخزنة والسماح لبرنامج تلفزيوني المتبقية لتتبخر دون القسم تجفيف تماما. رسم دائرة حول القسم على الجزء الخلفي من الشريحة. ثم، ضع قطرة من المتوسطة المتصاعدة على رأس العينة، والتأكد من أن الوسيلة تغطي القسم بأكمله ووضع بعناية غطاء الزجاج على القمة.
السماح لعينة البوليميراز بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في الصباح، ضع الشريحة تحت مجهر مسح الليزر الطيفي المقلوب. ضبط الهدف إلى 10x NA 0.40 أو 60x NA 1.4 لتحليل التعريب دون الخلوية السيتوكين.
في هذا البروتوكول، يتم تصور الخلايا التي تنتج إنترفيرون غاما وتحديد موقعها. العلامة F4/80 تسميات جميع الضامة ويسلط الضوء على اللب الأحمر. العلامة B220 تسميات الخلايا B ويسلط الضوء على بصيلات الخلية B المحيطة منطقة الخلية T.
علامة CD169 تسميات الضامة المنطقة الهامشية المحيطة اللب الأبيض. بعد 24 ساعة من العدوى، يتم إنتاج إنترفيرون غاما من قبل خلايا متعددة، بما في ذلك تنشيط المستضد المحدد OT1 CD8 الخلايا التائية وخلايا NK. دون استخدام BFA لمنع إفراز السيتوكين، كان الكشف عن إنترفيرون غاما من قبل خلايا NK ضعف كبير.
B الخلايا، الضامة المنطقة الهامشية، وجميع الضامة كانت ملطخة لتحديد موقع خلايا إنتاج غاما إنترفيرون بعد عدوى روفا. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على الخلايا التائية المتجمعة محددة موجودة في جميع أنحاء اللب الأبيض من الطحال، لكنها تنتج إنترفيرون غاما فقط في المناطق التي كانت تتعايش فيها خلايا NK معهم. تم عرض توطين مختلف دون الخلية من إنترفيرون غاما وNK مقابل CD8 إيجابية الخلايا التائية.
بينما تم نشر الانترفيرون جاما التعريب في خلايا NK في السيتوسول، CD8 إيجابية الخلايا التائية تجنيد غالباً إنترفيرون غاما نحو خلية T آخر. حقن brefeldin A أمر بالغ الأهمية للكشف عن السيتوكين في الموقع. الخلايا غالبا ما تفرز بسرعة و تأخذ السيتوكينات ونحن بحاجة إلى منع إفراز السيتوكين للسماح لها تتراكم في الخلايا.
هذا الأسلوب هو أداة اكتشاف التي تضع مرة أخرى الخلايا المنتجة للسيتوكين في بيئتها الأصلية. فك شفرة تكوين هذه البيئة يسمح لنا بالتركيز على الخلايا الصحيحة أو الوسطاء المناعيين الموجودين في هذا الموقع والتي يمكن أن تؤثر أو تتأثر بأشعة غاما. هناك فهم متزايد بأن توطين الخلية بدقة في الأنسجة أمر بالغ الأهمية لوظيفتها.
بروتوكول لدينا يسمح لنا لتحديد توطين الخلايا المنتجة السيتوكين وبالتالي، وميز وظيفتها.
