פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר לנו לדמיין את microenvironment שבו תאים לייצר ציטוקין נתון, כאן, אינטרפרון גמא. הוא הודה כי טווח הפעולה של ציטוקיני מוגבל כי רקמות הם כל כך מורכבים. חשוב לאפיין את התאים המקיפים תאים המייצרים גמא אינטרפרון כדי לאתר במדויק אילו תאים ייקחו אותו.
היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא אינה משבשת את המיקרו-וירוס הנוכחי ברקמת העניין. בנוסף, מכיוון שאנחנו לא מחדש באופן מלאכותי תאים כדי לאלץ אותם לייצר גמא אינטרפרון, זה נותן לנו אפיון טוב יותר של אם תאים מייצרים למעשה באופן פעיל אינטרפרון גמא במקום. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לאיברים אחרים ולהדמיה של ציטוקינים אחרים.
רוב השלבים בפרוטוקול זה הם פשוטים, אבל הטיפול ברקמה, הקפאה וקטע, צריך להתבצע בזהירות כדי לשמור על שלמות הרקמה. כדי להתחיל, להעביר 300 microliters של LM מתורבת מהונדסים גנטית כדי לבטא OVA עירוי לב מרק ב 37 מעלות צלזיוס בבקבוקון. מניחים את הבקבוק על שייקר לתסיסה עדינה כדי לגדל LM לשלב מעריכי עד OD600 מגיע 0.08 כדי 0.1.
לאחר דילול תרבות LM OVA ב PBS לריכוז של 0.1 פעמים מינון קטלני, 50%להשתמש מזרק אינסולין 29-מד להזריק דרך הווריד 100 microliters לתוך C57 שחור 6 עכברים מסוג פראי נמענים הנושאים OT1 GFP או OT1 RFP תאים. כדי לחסום הפרשת ציטוקינים 6 שעות לפני הקרבת העכבר, להזריק 250 מיקרוגרם של BFA ו 200 microliters של PBS תוך-אפית עם מזרק אינסולין 29-מד. לאחר המתת לחץ חם של עכברים באמצעות פחמן דו חמצני ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, לטהר את הבטן עם 70% אתנול.
באגף השמאלי של העכבר שבו הטחול ממוקם, לחתוך דרך העור עם מספריים כדי להפוך חתך של אחד עד שני סנטימטרים. לאחר מכן, בזהירות לעשות חתך ב peritoneum לחשוף את הטחול ולה להוציא אותו עם פינצטה. היזהר לא לסחוט אותו עם מדפים או לחתוך אותו כדי למנוע שיבוש ארכיטקטורת הטחול.
עכשיו, להכין את הפתרון התיקון על ידי ערבוב 3.75 מיליליטר של PBS ו 3.75 מיליליטר של 0.2 טוחן L-ליסטין. מוסיפים 21 מיליגרם נתרן m-periodate ומערבבים היטב. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיליליטר של 4%PFA ו-20 מיקרוליטרים של 12 נתרן הידרוקסידי רגיל.
חותכים את הטחול לשלושה חלקים. להטביע את הטחול ב fixative בצלחת שש באר ולתקן במשך מינימום של ארבע שעות. תקופת קיבוע טיפוסית היא 16 עד 20 שעות בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה.
לאחר מכן, להשליך את הפתרון התיקון ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, להחליף את PBS עם חמישה מיליליטר של 30% סוכרוז דגירה במשך 12 עד 24 שעות כדי לשמור על מורפולוגיה רקמה. עכשיו, האיבר שוקע בתחתית הצלחת.
כדי להקפיא את הדגימה, לשים קרח יבש בכלי קיבול גדול ולהניח כלי קיבול קטן יותר בפנים המכיל סביב 50 מיליליטר של מתנול טהור וכמה חתיכות של קרח יבש. מייבשים בעדינות את הטחול על מגבון ללא מוך. מטפטף טיפה של תרכובת OCT בתחתית תבנית הבסיס ומ מניחים את הטחול בתוך התבנית.
היזהר לא לייצר בועות. הוסף כמיליליטר אחד של OCT מעל הטחול. עם מדפים, להפקיד את עובש הבסיס על פני השטח של המתנול באמבט הקרח היבש, לוודא מתנול לא לגעת OCT.
OCT יהיה להתעבות ולהיות לבן כאשר קפוא. זכור להקפיא את הרקמה במהירות האפשרית כדי למזער חפצים. על קריו-מיקרוטום, מוגדר לטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
מדורים את הרקמה לעובי הרצוי, סביב 10 מיקרומטר. השתמש במברשת כדי לאסוף מקטעים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולבדוק באופן חזותי. אפשר לחלקים להגיע לטמפרטורת החדר.
צייר עיגול עם חוסם נוזלים, לדוגמה, עט PAP, סביב קטע הרקמה מחוץ ל- OCT. לאחר הרקמה התייבש, rehydrate המדגם על ידי טפטוף 100 microliters של PBS על סעיף הרקמה במשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את PBS מהסעיף על ידי שאיפה ולהוסיף 100 microliters של פתרון חסימה לכל סעיף מדגם.
דגירה בתא רטוב מכוסה למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. כדי להכתים בנוגדנים ראשוניים, החלף את פתרון החסימה בתערובת הנוגדנים הראשונית המוכנה עבור כל דגימה. דגירה במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא רטוב מכוסה לפני הכביסה על פי כתב היד.
עכשיו, לדלל את הנוגדנים המשניים של עניין לריכוז אופטימלי, בדרך כלל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, בתת פתרון החסימה. מוציאים את פתרון הכביסה הסופי מהקטע ומוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית המוכנה על גבי החלק ודורגים במשך שעה עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר בתא רטוב מכוסה. לאחר שטיפה עם חיץ כביסה על פי כתב היד, להסיר את פתרון לשטוף ולבצע שטיפה סופית עם PBS.
שאפו את תמיסת החום עם מאגר הפוספט ואפשרו ל-PBS הנותר להתאדות מבלי שהקטע יתייבש לחלוטין. צייר עיגול מסביב למקטע בגב השקופית. לאחר מכן, מניחים טיפה של מדיום הרכבה על גבי המדגם, מוודאים שהמדיום מכסה את כל החלק ומ מניחים בזהירות כיסוי על גבי.
תן לדגום פולימראז לילה בטמפרטורת החדר בחושך. בבוקר, מקם את השקופית תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר ספקטרלי הפוך. התאם את המטרה ל- 10x NA 0.40 או 60x NA 1.4 לניתוח לוקליזציה תת-תאית ציטוקינית.
בפרוטוקול זה, תאים המייצרים גמא אינטרפרון הם חזותיים וממוקמים. הסמן F4/80 מתייג את כל המקרופגים ומדגיש את העיסה האדומה. הסמן B220 מתייג תאי B ומסמן זקיקי תא B המקיפים את אזור תאי ה- T.
סמן CD169 מתייג מקרופאגים של אזורים שוליים המקיפים את העיסה הלבנה. 24 שעות לאחר ההדבקה, אינטרפרון גמא מיוצר על ידי תאים מרובים, כולל מופעל אנטיגן ספציפי OT1 CD8 T-תאים ותאי NK. ללא שימוש ב- BFA כדי לעכב הפרשת ציטוקין, הזיהוי של גמא אינטרפרון על ידי תאי NK נפגע מאוד.
תאי B, מקרופאגים של אזורים שוליים וכל המקרופאגים הוכתמו כדי לתווים את המיקום של תאים המייצרים אינטרפרון גמא בעקבות זיהום LM OVA. מעניין, אנטיגן מקובץ תאים ספציפיים T נמצאו ממוקם לאורך עיסת לבן של הטחול, אבל הם מייצרים גמא אינטרפרון רק באזורים שבהם תאי NK היו דו קיום איתם. לוקליזציה תת-תאית שונה של גמא אינטרפרון ו- NK לעומת תאי T חיוביים של CD8 הוצגה.
בעוד לוקליזציה של אינטרפרון גמא בתאי NK התפשטה בציטוזול, תאי T חיוביים של CD8 גייסו לעתים קרובות גמא אינטרפרון לכיוון תא T אחר. הזריקה של ברפלדין A היא חיונית כדי לזהות את ציטוקין באתרו. תאים לעתים קרובות מפרישים במהירות ולקחת את הציטוקיני ואנחנו צריכים לעכב הפרשת ציטוקין כדי לאפשר לו להצטבר בתאים.
שיטה זו היא כלי גילוי הממקם בחזרה את הציטוקין המייצר תאים בסביבתם המקורית. פענוח הרכב הסביבה מאפשר לנו להתמקד בתאים הנכונים או במתווכים החיסוניים הקיימים במיקום זה שיכולים להשפיע או להיות מושפעים מאינטרפרון גמא. ישנה הבנה גוברת כי לוקליזציה מדויקת של תא ברקמה חיונית לתפקודו.
הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לזהות את לוקליזציה של תאי ייצור ציטוקינים ובכך, לאפיין עוד יותר את תפקידו.
