في هذا البروتوكول ، تم بناء ملح السلفونيوم الذي يمكن أن يكون بمثابة يد جديدة تتفاعل مع بروتين السيستين على القرب الخاص. كانت ميزة هذه التقنية هي أن هذا التفاعل كان سريعا وفعالا ، وخاليا من محفز الميت وطور طريقة بسيطة وفعالة لتثبيت الببتيدات. للبدء ، قم بإعداد محلول إزالة الحماية N-terminal 9-fluorinyl-methyloxycarbonyl من 20٪ بيبيريدين أو 50٪ مورفولين و DMF في دورق أو دورق سعة 500 ملليلتر.
بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من محلول إزالة الحماية إلى العمود والنيتروجين الفقاعي في المحلول لمدة 30 دقيقة أو مرتين لمدة خمس دقائق. استنزاف الحل بواسطة مضخة فراغ وغسل الراتنج بالتتابع لمدة خمس مرات مع ثنائي كلورو ميثان و N، N-ثنائي ميثيل الفورماميد. للكشف عن الراتنج كمحلول أصفر داكن اللون ، أضف ملليلتر واحد من N ، N-dimethylformamide إلى كمية صغيرة من الراتنج وأضف 200 ميكرولتر من 5٪ نينهيدرين إلى أنبوب زجاجي.
قم بتسخينه عند 130 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لتقييم التغيرات في لون الراتنج. لاقتران الببتيدات ، قم بإعداد محلول خليط كما هو موضح في المخطوطة في أنبوب بولي بروبيلين وقم بحله في ثلاثة ملليلتر من N ، N-dimethylformamide. ثم أضف 173 ميكرولترا من N أو N-diisopropylethylamine أو 154 ميكرولترا من N، N'diisopropylcarbodiimide إلى المحلول لتعطيل الحمض الأميني.
بعد ذلك ، أضف الخليط إلى العمود بالراتنج وقم بفقاعته بالنيتروجين لمدة ساعتين. بعد الاقتران ، أضف ملليلتر واحد من N ، N-dimethylformamide إلى كمية صغيرة من الراتنج وأضف 200 ميكرولتر من 5٪ نينهيدرين إلى أنبوب زجاجي. قم بتسخينه عند 130 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق بينما تغير الراتنج إلى عديم اللون مما يؤكد عدم وجود مجموعة أمينية حرة قبل خطوة إزالة الحماية.
بعد تصريف المحلول ، اغسل الراتنج كما هو موضح سابقا وأضف 10 ملليلتر من محلول إزالة الحماية إلى العمود. ثم ، فقاعة مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة أو مرتين لمدة خمس دقائق. ومرة أخرى ، أضف حلا جديدا.
أضف 10 ملليلتر من الميثانول اللامائي إلى العمود مع الراتنج للتجفيف وجفف بالنيتروجين للاستخدام التالي. تزن 100 ملليغرام من الراتنج في عمود وتغسل الراتنج مع ثنائي كلورو ميثان و N ، N-dimethylformamide قبل خطوة اقتران. تحضير محلول لإزالة مجموعة الحماية من التريتيل-إل-سيستين عن طريق إضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك وثلاثي أيزوبروبيل سيلان وخليط ثنائي كلورو ميثان في دورق أو دورق سعة 100 ملليلتر لإزالة المجموعة الواقية.
أضف خمسة إلى 10 ملليلتر من المحلول المحضر إلى العمود لإزالة مجموعة الحماية لمدة 10 دقائق. كرر ست مرات مع فقاعات النيتروجين حتى يختفي اللون الأصفر تماما. بعد تصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ ، اغسل الراتنج كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول للتفاعل مع السيستين غير المحمي عن طريق إضافة رابط ثنائي الهلجنة و N ، N-diisopropylethylamine في دورق أو دورق سعة 50 ملليلتر مع N ، N-dimethylformamide. أضف خمسة إلى 10 ملليلتر من محلول التفاعل إلى العمود للتفاعل مع السيستين المحمي لمدة ثلاث ساعات على الأقل مع فقاعات النيتروجين. مرة أخرى ، قم بتصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع كما هو موضح سابقا.
لتحضير محلول تدوير الببتيد، أضف خليط حمض ثلاثي فلورو أسيتيك في دورق سعة 20 ملليلتر أو دورق في غطاء الدخان لتدوير الببتيد. بعد ذلك ، أضف خمسة إلى 10 ملليلتر من محلول الخليط إلى أنبوب البولي بروبلين وشق الراتنج تحت كوكتيل حمض ثلاثي فلورو أسيتيك لمدة ثلاث ساعات. بعد تجفيف الراتنج وغسله قبل أن يتم توضيح خطوة الاقتران مسبقا ، قم بإعداد محلول مائي من حمض الفورميك بنسبة 1٪ وبروميد بروبارجيل مليمولار واحد وأضفه إلى محلول ببتيد الميثيونين.
بعد ذلك ، هز تفاعل اقتران الميثيونين وبروبارجيل بروميد في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة. بعد التفاعل ، قم بإذابة المنتج في أنبوب بولي بروبيلين وأسيتونيتريل وقم بترشيحه من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتنقية المحلول عن طريق المرحلة العكسية HPLC على الفور وقم بتجميده وجففه إلى مسحوق للاستخدام التالي.
تميزت الببتيدات الحلقية المركبة باستخدام ثنائي الألكلة بين السيستين والميثيونين بواسطة طيف HPLC و LCMS ، مما يدل على أن البشرة أظهرت أوقات احتفاظ مميزة وأوزان جزيئية متطابقة. أظهرت آثار HPLC للبشرة ومنتجها المترافق التحويل المعتمد على الوقت بين الببتيد الدوري ومنتجه. تم تحديد الوزن الجزيئي للببتيدات الحلقية التي تم تصنيعها باستخدام تفاعل من نوع ثيول ين بواسطة LCMS وتم عزل الببتيد وتنقيته بواسطة HPLC.
تم تمييز الببتيدات أيضا بواسطة البروتون NMR والأطياف المتماسكة الكمومية الأحادية غير المتجانسة ، مما يكشف عن التحول الكيميائي. تم الحصول على أطياف البروتون NMR للتحويل المعتمد على الوقت بين الببتيد الدوري وثنائي ثيوثريتول وأكسيد الديوتيريوم لاستكشاف استقرار الببتيد بسبب فتح حلقة السلفونيوم. أظهرت النتائج أنه لم يتم تشكيل أي منتجات إضافة أو فتح حلقة بعد 24 ساعة.
أنشأ هذا الإجراء استراتيجية فعالة لتوليف الببتيدات الدورية. يقول التفاعل إن الانتقائية تعززت أيضا من خلال تشكيل تأكيد يعمل على استقرار الببتيد الدائري ، مما يشير إلى أن الببتيدات الدورية كانت محفزا دوائيا واعدا.
