هذا البروتوكول يتيح لنا رصد ديناميات التفاعل ودقة تقاطع هوليداي من قبل رفرف endonuclease 1 على مستوى جزيء واحد وغيرها من النظم الأنزيمية. حسنا، بعض سوف متوسط في جميع أنحاء السكان الجزيئية أو يؤمن الخطوات الآلية الفردية الكامنة وهناك. توفر طرق الجزيء المفرد هذه التفاصيل من خلال مراقبة سلوك الجزيئات الفردية في الوقت الحقيقي.
يمكن لطرق الجزيء الواحد أن تكتشف التفاعلات الجزيئية الحيوية بكفاءة في نطاق البيكو و nanomolar مع خصوصية عالية. وهو مفيد للعديد من الحلول العملية في التشخيص ، وتسلسل الجينوم ، والاستشعار. البصرية والقسرية أساليب قياس جزيء واحد تطبق على نطاق واسع في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا وثبت أن تقديم ملاحظات النبيلة التي لا يمكن الوصول إليها من خلال أساليب أخرى.
نصيحتي للمستخدمين لأول مرة هو أن تتبع عن كثب الخطوات التفصيلية المنصوص عليها في هذا البروتوكول. وسوف تؤدي الرسوم التوضيحية المرئية للإجراء العملي لهذا البروتوكول إلى التنفيذ الناجح لهذه التقنية. لإعداد خلية تدفق قناة واحدة، تبدأ بحفر اثنين من ثقوب قطرها 1.22 ملليمتر في الجزء الأوسط من 50 في 20 ملليمتر انزلاق الكوارتز مع المراكز 37 ملليمتر عن بعضها البعض و 6.5 ملليمتر من حافة الشريحة.
استخدام قاطع الإلكترونية لقطع قناة 41 في 2.25 ملليمتر إلى قطعة 50 في 20 ملليمتر من ورقة لاصقة مزدوجة وتقشر قبالة الجانب البلاستيك من الغطاء الواقي. محاذاة حواف قطعة مع حواف الشريحة الكوارتز واستخدام زوج من ملاقط البوليتيترافلورو ايثيلين لإزالة بلطف أي فقاعات الهواء المحاصرين. قشر قبالة الجانب ورقة من قطعة لاصقة وجبل قطعة على سطح وظيفية من زلة الغطاء.
بعد ذلك، قطع قطعة واحدة من أنابيب البولي إيثيلين مع قطر داخلي من 1.22 ملليمتر إلى 11 سنتيمترا طولا للمدخل وقطعة واحدة من أنابيب إلى 25 سنتيمترا للمأخذ. ثم أدخل الأنابيب في الثقوب التي تم حفرها سابقًا كداخلة ومنافذ لخلية التدفق. واستخدام الغراء الايبوكسي خمس دقائق لختم حواف واجهة غطاء الكوارتز في مدخل ومنافذ الأنابيب.
عندما جفت الخلية، واستخدام حقنة 1 ملليمتر لطرد 0.2 ميكرومتر تصفية 0.03 ملليغرام لكل ملليلتر تركيز avidin في PBS في الخلية باستخدام حقنة ثانية مليئة المخزن وحده لغسل أي أفدين الزائدة في نهاية غزير. لتنفيذ تجربة FRET أحادية اللون، أولاً تطبيق قطرة واحدة من زيت الغمر على 100 مرة مجموع التركيز الداخلي الفلوري الهدف وتعيين على الضرب رقاقة من photoelectrons إلى مكسب مناسب لتحسين الإشارة إلى الخلفية ومنع التشبع. ضع خلية التدفق بعناية على حامل العينة، واستخدم تعديل الدورة التدريبية لرفع الهدف تدريجيًا حتى يلمس الزيت زلة الغطاء.
بدوره على الليزر 532 نانومتر والتبديل إلى وضع التكيف الدقيق للهدف. توجيه الانبعاثات إلى منفذ الكاميرا لمراقبة الصورة على الشاشة وضبط ارتفاع الهدف حتى يتم إحضار السطح الوظيفي لزلة الغطاء في التركيز ويمكن ملاحظتها على الشاشة. تحقق من أن الخلفية من السطح الوظيفي للزلات الغطاء لا يتجاوز عدد قليل من البقع قبل تتدفق في HJ المسمى fluorescently. عندما يكون النظام جاهزاً عند 0.2 إلى 0.5 ميكرولترات من الركيزة المخففة من الفائدة إلى 120 ميكرولترات من العازلة التصوير مع نظام الكسح الأكسجين في أنبوب 0.5 ملليلتر وربط منفذ الخلية البطيئة إلى مضخة حقنة.
أدخل أنبوب المدخل في أنبوب 1.5 ملليلتر وابدأ في مضخة الحقنة في 30 إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة لسحب المحلل من الأنبوب. صورة في كثير من الأحيان السطح لفترة وجيزة مع الليزر الأخضر لتأكيد تغطية جيدة من الخلية مع 100 إلى 300 جزيئات من الركيزة موزعة بشكل متجانس، متباعدة جيدا. إذا كان سطح الخلية تدفق مغطاة بشكل كاف، طرد آخر 120 ميكرولترات من العازلة التصوير في 30 إلى 50 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لغسل أي HJ غير منضم والسماح لخلية تدفق للجلوس لمدة 5 دقائق للسماح لنظام الاستنساب الأكسجين لاستنفاد الأوكسجين المذاب.
تعيين وقت التعرض إلى ما يقرب من 60 ميلي ثانية. سيتم تعيين وقت الدورة تلقائيا من قبل البرنامج على أساس سرعة نقل البيانات. حدد العدد المطلوب من الدورات أو الإطارات إلى 400 تقريبًا.
يتم تقسيم الانبعاثات من المتبرع وفلوروفهورات المتقبل إلى قنوات ملونة بواسطة جهاز تقسيم الصور. حدد منطقة مناسبة على السطح، وضبط ارتفاع الهدف للتركيز على الصورة وتسجيل وحفظ الفيلم في شكل tiff 16 بت. ثم الانتقال إلى منطقة جديدة.
قم بشطف الخلية بـ 120 ميكرولترات من عازلة التصوير المُكملة بتركيزات GEN1 المشار إليها بمعدل تدفق 30 ميكرولتر في الدقيقة، وتركيز واحد في كل مرة. في قرار التجربة انشقاق HJ، وضبط معدل التدفق إلى 110 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة وبدء تسجيل 5 إلى 10 ثوان قبل دخول الانزيم في خلية التدفق. التصوير لبدء 5 إلى 10 ثانية قبل دخول الانزيم في خلية تدفق سوف تعظيم عدد الأحداث.
عندما يتم اختبار جميع التركيزات، استخدم شريحة حبة فلورية ثابتة لرسم خريطة للذروة وجزيئات المتقبلة لبعضها البعض في جهاز تقسيم الصور. بعد تثبيت حزمة البرامج المناسبة لتوليد مصفوفة التحول، فتح الفيلم الشريحة حبة المسجلة وتحديد مواقف من الخرز الفردية في القنوات المانحة والمقبلة. عندما تم إنشاء المصفوفة من الشريحة حبة ثابتة انقر فوق تحميل TFORM وحدد ملف مصفوفة التحويل.
في القائمة المنسدلة من تصفية القناة، انقر فوق خيار D & A لتحديد الجسيمات التي تحمل اسم المتبرع والمقبِل. ثم، أدخل plotTimetraceCW كما هو مع تعليمات في الدليل لتوليد آثار الوقت لكل جزيء. لتنفيذ تجربة ALEX FRET ، سجل فيلم يتكون من إطارات متتالية من الانبعاثات المانحة والمقبِلة عن طريق الإثارة المباشرة مع الليزر الأخضر والأحمر.
فتح الأفلام التي تم الحصول عليها ALEX وتعيين عتبة الكشف المناسبة في حوالي 300 لكل من الانبعاثات المانحة بسبب الإثارة المانحة، والانبعاثات المقبولة بسبب الإثارة المانحة، والانبعاثات المقبولة بسبب قنوات الإثارة المباشرة. تطبيق مرشحات قناة مناسبة لتحديد للجسيمات التي كانت على حد سواء المانحة والمقبِل وربط 200 إلى 300 الجسيمات في كل من القنوات الثلاث. استخدام plotHistALEX MATLAB رمز لتوليد الرسوم البيانية اليكس تركيب قمم مختلفة في وظائف الرسم البياني واستخدام الرسم البياني مناسبة وتحليل البرنامج لتحديد النسبة المئوية للمنطقة تحت المنحنى لكل مجموعة سكانية.
ثم استخدم رمز MATLAB Time time for كل جزيء الذي يظهر انبعاث المتبرع بالإثارة المباشرة في الانبعاثات المقبولة بسبب FRET والإثارة المباشرة. هذا الممثل بالتناوب الإثارة FRET المدرج التكراري للتسمية المجاورة X-0 يظهر اثنين من القمم التي تتوافق مع interchanging من ايزومرات أكثر وفرة وأقل وفرة. وتتوافق معدلات الإيزومير التي تم الحصول عليها من مدرجات الزمن في سكن من الأيزومرات مع تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقاً.
جزيء واحد FRET المدرجات البيانية من تقاطع التسمية X-0 المجاورة في تركيزات GEN1 مختلفة التي اكتسبتها ALEX، تكشف عن ذروة واحدة المقابلة لايزومر فريت عالية حرة وذرية واحدة المقابلة للسكان HJ ملزمة بعد طرح مساهمة الايزومر أقل وفرة من ذروة فريت منخفضة. في تركيز GEN1 المشبعة، يحتوي الرسم البياني FRET X-0 على ذروة واحدة منخفضة من FRET تقابل GEN1 مرتبطة بأي من الأيزومر من HJ كما هو متوقع من قبل النموذج. إن ربط جين 1 مونومير بـ HJ متبوعاً بتشكيل أكثر لطفاً هو ميزة فريدة من سمات حل HJ أحادي النواة GEN1 مقارنة بالحلول البروكارية التي توجد في شكل ثنائي وميريكي في الحل.
مزيد من الأدلة على أن GEN1 مونومر يربط ويشوه HJ هو ملاحظة عدد كبير من آثار الجسيمات غير المكدّسة مع حالة فريت منخفضة مستقرة في وجود المغنيسيوم في تركيزات منخفضة GEN1. رحيل المانح والمقبِل في وقت واحد بعد حالة من حالة FRET المنخفضة المستقرة في آثار X-0 التي تم حلها دون ظهور وسيط يشير إلى أن حل كامل يحدث في غضون عمر مجمع GEN1 HJ. لاحظ أن الخلفية من سطح الزجاج الوظيفية يجب ألا تتجاوز بعض البقع وأن الجسيمات الموزعة بالتساوي ضرورية للحصول على نتائج جيدة.
استخدم دائماً معدات الحماية الشخصية وغطاء أبخرة أثناء إعداد صورة التسلسل. تأكد من ارتداء نظارات واقية خاصة بأطوال الموجة عند العمل مع الليزر. أساليب أخرى مثل كريو أب، الرنين المغناطيسي النووي، يمكن أن توفر تفاصيل هيكلية المستوى الذري.
هذه المعلومات هي جزء لا يتجزأ من تصميم وتفسير جزيء واحد تجارب فريت. جزيء واحد FRET فتح وجهات نظر جديدة في مجال النسخ المتماثل الحمض النووي مما أدى إلى فهم أعمق لآليات الإجراءات الهليفات والنيوكلاسيس.
