Parasponia هي شجرة استوائية من عائلة القنب التي هي قادرة على إنشاء تكافل النيتروجين تحديد مع رهيزوبيوم. يمكن أن توفر الدراسات المقارنة بين Parasponia والبقوليات نظرة ثاقبة على الشبكات الوراثية الأساسية الكامنة في تكافل رهيزوبيوم. مع هذا البروتوكول، يمكن إنشاء خطوط طفرات مستقرة في اِلَرَسِرُنِية أندرسوني في فترة من شهرين إلى ثلاثة أشهر.
ويمكن نشر هذه الخطوط بكفاءة من خلال الانتشار في المختبر. يوفر هذا البروتوكول منصة تجريبية لدراسة التكافل رهوبيال فضلا عن جوانب أخرى من بيولوجيا هذه الشجرة الاستوائية. والمهارات الأساسية في زراعة الأنسجة والاستنساخ الجزيئي كافية لتنفيذ هذا البروتوكول.
وهذا يسمح لأي مختبر لتكييف بارابونيا كنموذج للبحوث. وسوف يكون هذا الإجراء الطالبين الدكتوراه تيتس وردهاني ويودا Roswanjaya جنبا إلى جنب مع هارتوغ ماريكي، وهو فني في مختبرنا. لزراعة الأشجار أندرسوني Parasponia، تبدأ من خلال الإنبات البذور.
إزالة البذور من التوت Parasponia عن طريق فرك ضد داخل منخل الشاي أو سحق لهم على قطعة من الورق الأنسجة. تطهير البذور باستخدام 4٪ تبييض هيبوكلوريت لمدة 15 إلى 20 دقيقة، ثم غسل البذور ست مرات مع المياه المعقمة. نقل البذور إلى العقيمة 200 ميكرولتر أنابيب PCR، وملء الأنابيب مع تعقيم المياه لغمر البذور.
احتضان الأنابيب لمدة 10 أيام في ثيرموسايرتر وفقا لاتجاهات المخطوطات. بعد الحضانة لمدة 10 أيام، ونقل البذور إلى لوحات SH-0، وإغلاقها مع طبقتين من رقائق ختم مرنة لمنع التجفيف. احتضان في 28 درجة مئوية مع 16 ساعة في اليوم، ودورة ثماني ساعات ليلا لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع.
بمجرد أن تطور الشتلات أول مجموعة من الأوراق الحقيقية ، ونقلها إلى الأواني المليئة بتربة بوتينغ التجارية ، وتغطيتها بكأس بلاستيكي شفاف لمنع جفافها. وضع الأواني في 28 درجة مئوية، 85٪ غرفة مناخ الرطوبة النسبية أو الدفيئة تحت نظام 16 ساعة في اليوم، ثماني ساعات ليلا. بعد أسبوع واحد، وإزالة كوب من البلاستيك.
بانتظام المياه الأواني، وتكملة مع الأسمدة للحفاظ على نمو الأشجار. الاستعداد للتحول من خلال حصاد فروع الشباب من خمسة إلى ثمانية سنتيمترات من الأشجار المزروعة في الدفيئة، مع التأكد من استخدام فروع صحية فقط غير مصابة. قطع الأوراق، وترك سنتيمتر واحد مربع من الأنسجة ورقة في نهاية كل petiole.
تطهير الأنسجة لمدة 15 دقيقة مع 2٪ تبييض هيبوكلوريت تحتوي على بضع قطرات من البوليsorbate 20، ومن ثم شطفه ثماني مرات بالماء autoclaved. إعادة تعليق الخلايا الجرثومية في 25 ملليلتر من التسلل المتوسطة إلى كثافة بصرية من حوالي خمسة. قطع الجذعية والأنسجة petiole إلى قطعة سنتيمتر واحد داخل تعليق الخلية.
إزالة الأنسجة ورقة واحتضان قطع الجذعية وpetiole في تعليق الخلية لمدة 10 إلى 30 دقيقة. جفف قطع الأنسجة على قطعة معقمة من ورق التصفية ووضعها على وسط التأصيل المعد وفقًا لاتجاهات المخطوطات. احتضان لوحات في الظلام في 21 درجة مئوية لمدة يومين.
بعد اليومين ، تفقد لوحات للتلوث الفطري أو البكتيري والتخلص من اللوحات الملوثة. نقل قطع الأنسجة إلى 10 ملليلتر من المتوسط SH-10 أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات. اترك النسيج في الوسط لمدة 10 دقائق على الأقل، واثاره بلطف كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق للاغتسال.
إعداد التسميد مع cefotaxime وkanamycin وفقا لتوجيهات المخطوطة، وصب لوحات. جفف الأنسجة على قطع معقمة من ورق التصفية، ونقلها إلى الأطباق. احتضنت الصفائح لمدة سبعة أيام على حرارة 28 درجة مئوية تحت نظام مدته 16 ساعة، وثماني ساعات.
تحقق من اللوحات للتلوث الفطري أو البكتيري كل يومين. إذا حدث تلوث، نقل قطع الأنسجة غير المصابة إلى لوحة جديدة. بعد سبعة أيام، قم بنقل قطع الأنسجة إلى وسيطة نشر أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات واحتضان في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة، ثماني ساعات ليلا.
تحديث لوحات مرة واحدة في الأسبوع حتى يطلق النار على المعدلة وراثيا تطوير، مع التأكد من نقل فقط قطع الأنسجة غير المصابة إلى لوحات جديدة. مرة واحدة يطلق النار المعدلة وراثيا المفترضة هي ما لا يقل عن سنتيمتر واحد طويلة، وقطع يطلق النار وثقافتها بشكل مستقل في متوسطة الانتشار مع المضادات الحيوية. لضمان أن يطلق النار تمثل محولات مستقلة، تأخذ فقط تبادل لاطلاق النار واحد من كل جانب من explant.
نشر الأنسجة عن طريق وضع حوالي 10 يطلق النار على لوحة جديدة من انتشار المتوسطة وإغلاق لوحة مع طبقتين من رقائق ختم مرنة. احتضان لوحات في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة في اليوم، ثماني ساعات ليلا، وتكرار هذه الخطوة كل أربعة أسابيع. عندما يطلق النار تصل إلى سنتيمتر واحد في الطول، وقطع لهم في قاعدتهم ووضعها على وسيط التأصيل.
ضع البراعم منتصبة عن طريق إدراج الطرف القاعدي من تبادل لاطلاق النار في الوسط. ويمكن وضع حوالي 10 يطلق النار على لوحة واحدة. ابدأ بإعداد ريزوبيوم إنوكولوم.
تلقيح 10 ملليلتر من السائل YEM المتوسطة من مستعمرة واحدة من مسورثيوزوبيوم متعدد الفاترونوم BOR2، واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة يومين. استخدم هذه الثقافة لتطعيم حجم أكبر من الوسيطة YEM السائلة. مرة واحدة نمت، الطرد المركزي الثقافة البكتيرية لمدة 10 دقائق في 3،500 مرات ز لحصاد الخلايا.
إعادة تعليق بيليه بكتيرية في السائل EKM المتوسطة، وتحديد الكثافة البصرية. إعداد ثلاثة لترات من EKM المتوسطة، وهو ما يكفي لحوالي 20 الأواني، وتطعيم مع تعليق rhizobial. اخلطي الوسط مع 1.25 كيلوغرام من البيرلايت، وأضيفي 210 جرام من هذا الخليط إلى أواني البولي بروبلين شفافة معقمة.
زرع واحد إلى ثلاثة Plantlets Parasponia أندرسوني لكل وعاء، وإعداد عدة الأواني مع بلانتليتات تحولت مع بناء السيطرة. تزن العديد من الأواني، وتغطي الجزء السفلي من كل وعاء لحماية الجذور من التعرض للضوء. احتضان الأواني في غرفة النمو المناخية في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة، ثماني ساعات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع.
مرة واحدة في الأسبوع، تزن عدة الأواني لتحديد فقدان المياه. إذا كان فقدان المياه يتجاوز 10 ملليلتر، تكملة مع المياه النقية جدا للتعويض عن الخسارة. بعد الحضانة، وتنظيف الجذور من البيرلايت، وتحديد أعداد العقيدات باستخدام منظار.
وقد استخدمت هذه التقنية لتحويل بنجاح petioles وشرائح من سيقان أندرسوني Parasponia مع سلالة AGL1 Agrobacterium. أولاً، يتم زراعة الأنسجة مع البكتيريا الزراعية لمدة يومين. وينبغي منع الزراعة المشتركة لفترات طويلة من الإفراط في الاستعمار البكتيري.
وبعد بضعة أسابيع، لوحظ صغيرة صغيرة كالي على طول سطح الجرح الأصلي. تستمر هذه الـ calli في النمو وتطوير واحد أو أكثر من يطلق النار على نحو مُنُحوَل بشكل مُنَمَنِي بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من بداية التحوّل. تتفاوت كفاءة التحول من 10 إلى 30٪ بالنسبة لتكذُر الأنسجة من الفروع الناضجة إلى 65 إلى 75٪ لتكلات الأنسجة من الفروع الصغيرة والسريعة النمو.
يمكن ضرب البراعم المعدلة وراثيا من خلال الانتشار في المختبر، مما يؤدي إلى عشرات من يطلق النار في غضون شهر. ويمكن وضع هذه البراعم على التوسط التأصيل التي من شأنها أن تحفز تشكيل الجذر في حوالي أسبوعين والنباتات التي يمكن أن تنتج يمكن استخدامها للتجريب. عند بدء تجربة التحول مستقرة، من المهم تحديد فروع صحية كمادة المصدر.
يتم نشر خطوط باراسبونيا T0 المعدلة وراثيا في المختبر. ولذلك، فمن الضروري أن شامل الجينوم خطوط بارابونيا المعدلة وراثيا. ويتيح إنشاء باراسبونيا كنموذج تجريبي إجراء تحليل مقارن بين نسبين ذيي صلة بعيدة، هما باراسبونيا والبقوليات.
وهذا يمكن أن يحدد الحفاظ على الشبكات الوراثية الكامنة في تكافل رهيزوبيوم. يمكن أن يكون Parasponia أيضا نموذجا قيما لدراسة مواضيع بحثية أخرى مثل تكوين الخشب، وتطوير الزهور المخنثين، أو التركيب الحيوي من المستقلبات الثانوية الخاصة Cannabaceae.
