الأعضاء الدماغية البشرية هي أداة هامة لدراسة الأمراض في نظام يسهل التلاعب به ويتضمن بيئة الإنسان والتفاعل المناسب لأنواع الخلايا المتعددة. يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة العديد من أمراض الدماغ ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية ، والشتائم السامة ، ونمو وعلاج السرطان في الدماغ. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو القدرة على توليد organoids الدماغ استنساخه للغاية مع مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الخلايا العصبية.
ويتم ذلك باستخدام سير العمل التبسيطي للغاية التي يمكن إنجازها من قبل معظم المختبرات. ويتم إنتاج هذه بطريقة مناسبة مؤقتة دون تأثير من عوامل النمو المتخصصة أو المصفوفات غير المحددة مما يجعلها بسيطة جدا وفعالة من حيث التكلفة النظام. للبدء، والجمع بين 100 ميكرولترات من مصفوفة مع 5.9 ملليلتر من الجليد الباردة Dulbecco 'sعدل النسر المتوسطة أو F12 وسائل الإعلام في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
معطف كل بئر في لوحة ستة جيدا مع ملليلتر واحد من مصفوفة الغشاء. التفاف لوحة في فيلم البارافين وتخزينها بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، تُفطّن وسائط زائدة من كل بئر ، وشطف الآبار بـ F12 ، وأضف H9 hESCS في حجم إجمالي قدره ملليلتر من الوسائط mTeSR1 في البئر.
ثقافة الخلايا من أسبوع إلى أسبوع. تزويد يوميا مع مليلترين من وسائل الإعلام mTeSR1 ووضع لوحة في حاضنة الأكسجين منخفضة 37 درجة مئوية مع 5٪ من الأوكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدام أدوات الزجاج لل التخلص من الخلايا التمييزية من الثقافة بين الممرات.
تحديث وسائل الإعلام يوميا. الخلايا ينبغي أن تمر أربعة إلى ستة أيام قبل استخدام الخلايا H9 لإنتاج organoid. لتمرير الخلايا، تبدأ بشطف لهم مع وسائل الاعلام DMEM F12 وpirating السائل الزائد.
بعد الشطف، إضافة محلول البروتياز واحتضان الخلايا لمدة 40 دقيقة من أجل المستعمرات لتعويم داخل البئر. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DMEM F12 وإذا لزم الأمر قم بتمليك لجعل القطع أصغر. ثم توزيع الخلايا بنسبة واحد إلى ثمانية تقريبية على أربع لوحات ستة آبار ووضع لوحات في الحاضنة وتغذية يوميا.
بعد أربعة إلى ستة أيام، تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80٪التقاء. تحويلها إلى حاضنة عادية. تخفيف محلول الأسهم protease إلى تركيز العمل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل الأسهم إلى خمسة ملليلتر من DMEM أو F12 المتوسطة لكل لوحة ستة-well من hESCS.
التعرق وإزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية، ثم تغطية hESCS مع حل protease. ضع اللوحات في الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة أو حتى تستدير حواف المستعمرات وتبدأ في الانفصال عن المصفوفة ولكن قبل أن تُدور بالكامل. إمالة لوحة، وpirate حل البروتياز، وغسل بلطف الخلايا مع ملليلتر اثنين من DMEM أو F12 لكل بئر ثلاث مرات.
تأكد من بقاء المستعمرات متصلة بالمصفوفة. لذلك من المهم أن تكون قطع خلايا ES في الحجم المناسب لذلك تأكد من أنها في حالة عدم تجزئة للفترة الزمنية المناسبة. إذا كانوا هناك لفترة قصيرة جدا من الوقت، يمكن أن يكون من الصعب جدا لطرد لهم وكسرها بعيدا.
وإذا كانوا هناك لفترة طويلة جدا، فإنها يمكن أن تأتي في الواقع قبالة فقط خلال خطوات الغسيل. إضافة مرة أخرى عن واحد إلى 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام mTeSR الطازجة إلى كل بئر ومسح الخلايا قبالة لوحة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر باستخدام الأنابيب لطيف. التعرق والاستغناء hESCS داخل لوحة حتى تصل إلى ما يقرب من 1/30th من حجمها الأصلي.
الآن تشبه مجموعات مستعمرة 250 إلى 350 قطعة ميكرومتر الحجم. نقل الخلايا إلى قارورة T75 مرفق منخفضة جدا واحدة تحتوي على 30 ملليلتر من وسائل الإعلام mTeSR دون bFGF. في اليوم التالي، إمالة القارورة بحيث تجمع الخلايا الحية في الزاوية.
إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا التي التزمت بأسفل القارورة، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل الخلايا إلى قارورة جديدة. نتوقع أن يكون عدد كبير من الخلايا الميتة في الأيام القليلة الأولى. مرة واحدة تستقر الخلايا، وpirate قبالة وسائل الإعلام والخلايا الميتة ترك حوالي 10 ملليلتر من وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الحية وإضافة 20 ملليلتر من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكمل مع 30 نانوغرام لكل ملليلتر من bFGF.
بعد يومين، تحقق من الخلايا. معظم الخلايا يجب أن تبدو صحية ومشرقة. ومع ذلك، إذا ظهر أكثر من ثلث الخلايا داكنة، إمالة القارورة واستبدال 20 ملليلتر من وسائل الإعلام مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكملها 20 نانوغرام لكل ملليلتر من bFGF.
في اليوم الثالث، قم بإزالة نصف الوسائط واستبدلها بـ 15 ملليلترًا من وسائط hESC مدعومة بـ 10 نانوجرامات لكل ملليلتر من bFGF. في اليوم الخامس، استبدل نصف وسائل الإعلام بـ 15 ملليلتر من وسائل الإعلام التعريفية العصبية. بعد ذلك، كل يومين، استبدل نصف الوسط بالوسائط التعريفية العصبية.
بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة، إضافة 100X البنسلين-ستريبتوميسين إلى وسائل الإعلام في تركيز النهائي من 1X إذا رغبت في ذلك. تحديث نصف وسائل الإعلام كل يومين. في هذا البروتوكول ، بدا الأعضاء المتشكلة في الدماغ مشرقة ومتشابهة في الحجم دون خلايا الموت الداكنة في مراكز هذه المجموعات.
تم فرام الخلايا تدريجيا قبالة bFGF. في اليوم الخامس، تم وضعها في وسائل الإعلام التعريفي العصبية وبقيت في هذه الوسائط طوال فترة الثقافة. على الرغم من أن الأعضاء أصبحت أكبر وبالتالي أكثر قتامة مع مرور الوقت ، توسعت الهياكل العصبية الشبيهة بالورود مما يشير إلى بدء التمايز العصبي ويحتوي على ميزات الأنبوب العصبي الجنيني.
لإلقاء نظرة أكثر تعمقا على التعبير الجيني داخل الخلايا، تم إجراء تحليل qPCR. تم التعبير عن الناقل الغلوتامات VLGUT1 في أسبوعين ونصف، وزيادة في خمسة أسابيع، وظلت متسقة خلال خمسة أشهر من الثقافة. تم التعبير عن علامة forebrain Foxg1 عند مستويات منخفضة حتى خمسة أسابيع في الثقافة.
بلغت علامة الطبقة العميقة Tbr1 ذروتها حوالي خمسة أسابيع وانخفضت لاحقًا. في حين أن التعبير عن علامة الطبقة العليا Satb2، وعلامة البطينية Eng1، وعلامة الحبل الشوكي هندبرين Hoxb4، فضلا عن علامة oligodendrocyte Olig2 جميع زيادة مع مرور الوقت. في المقابل، انخفض مؤشر الخلايا الجذعية Sox2 مع مرور الوقت.
وبلغت العلامة الدبقية GFAP ذروتها في خمسة أسابيع وظلت ثابتة نسبيا في وقت لاحق. تذكر أن تأخذ أقصى درجات الحذر عند التعامل مع خلايا ES في المرحلة المبكرة organoids لتجنب التلوث كما انهم نمت دون المضادات الحيوية وتذكر أيضا أن تتغذى وفقا للجدول الزمني. بعد هذا الإجراء، يمكنك تقييم العضيات باستخدام تقنيات مثل الـ RT-PCR الكمي للتعبير الجيني وflufluorescence للتعبير عن البروتين والتوطين.
باستخدام هذه التقنية، تمكنا من دراسة قدرة جزيء صغير على تخفيف جوانب إصابة نقص الأكسجة الوليدية البشرية على غرار غرفة نقص الأكسجة. ومن المهم أن هذه الأعضاء الدماغ البشري تصرفت على نحو مماثل في تجارب الماوس الجسم الحي.
