Los organoides cerebrales humanos son una herramienta significativa para estudiar enfermedades en un sistema que se manipula fácilmente e incorpora un entorno humano y la interacción adecuada de múltiples tipos celulares. Esta técnica se puede aplicar para estudiar numerosas enfermedades del cerebro, incluyendo trastornos del neurodesarrollo, insultos tóxicos, y el crecimiento y tratamiento del cáncer en el cerebro. La principal ventaja de este protocolo es la capacidad de generar organoides cerebrales altamente reproducibles con una amplia variedad de tipos de células neuronales.
Esto se hace utilizando un flujo de trabajo muy simplista que podría ser logrado por la mayoría de los laboratorios. Y estos se producen de manera apropiada temporal sin la influencia de factores de crecimiento especializados o matrices indefinidas que lo convierten en un sistema muy simple y rentable. Para empezar, combine 100 microlitros de matriz con 5,9 mililitros de medios Modified Eagle Medium o F12 de Dulbecco en un tubo cónico de 15 mililitros.
Recubrir cada pozo en una placa de seis pozos con un mililitro de la matriz de membrana. Envuelva el plato en película de parafina y guárdelo durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, aspirar el exceso de medios de cada pozo, enjuagar los pozos con F12, y añadir H9 hESCS en un volumen total de dos mililitros de medios mTeSR1 por pozo.
Cultiva las células de semana a semana. Suministrar diariamente dos mililitros de medios mTeSR1 y colocar la placa en una incubadora de bajo oxígeno de 37 grados Celsius con 5% de oxígeno y 5% dióxido de carbono. Utilice herramientas de vidrio para eliminar las células diferenciadoras del cultivo entre pasajes.
Actualice los medios todos los días. Las células deben ser pasajes de cuatro a seis días antes de utilizar las células H9 para la producción de organoides. Para pasar las células, comience enjuagando con medios DMEM F12 y aspirando el exceso de líquido.
Después de enjuagar, añadir la solución de proteasa e incubar las células durante 40 minutos para que las colonias floten dentro del pozo. A continuación, lave las células tres veces con DMEM F12 y, si es necesario, emente para hacer las piezas más pequeñas. Luego distribuya las células en una proporción aproximada de uno a ocho sobre cuatro placas de seis pozos y coloque las placas en la incubadora y alimente diariamente.
Después de cuatro a seis días, las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Transición a una incubadora regular. Diluir la solución de material proteasa a una concentración de trabajo añadiendo un mililitro de la solución de stock a cinco mililitros de DMEM o F12 medio por cada placa de seis pozos de hESCS.
Aspirar y eliminar el medio de cultivo celular, luego cubrir el hESCS con la solución de proteasa. Coloque las placas en la incubadora durante 10 a 15 minutos o hasta que los bordes de las colonias redondeen hacia arriba y comiencen a separarse de la matriz, pero antes de que se redondeen por completo. Incline la placa, aspire la solución de proteasa y lave suavemente las células con dos mililitros de DMEM o F12 por cada pozo tres veces.
Asegúrese de que las colonias permanezcan unidas a la matriz. Por lo tanto, es fundamental que las piezas de las células ES tengan el tamaño adecuado, así que asegúrese de que están descontentas durante la cantidad de tiempo adecuada. Si están ahí por un tiempo demasiado corto, puede ser muy difícil eliminarlos y separarlos.
Y si están ahí por mucho tiempo, en realidad pueden salir durante los pasos de lavado. Agregue de nuevo alrededor de uno a 1,5 mililitros de medios mTeSR frescos a cada pozo y enjuague las células de la placa en un tubo cónico de 50 mililitros usando un pipeteo suave. Aspirar y dispensar hESCS dentro de la placa hasta que alcancen aproximadamente 1/30 de su tamaño original.
Ahora los racimos de colonias se asemejan a piezas de 250 a 350 micrómetros. Transfiera las células a un único matraz T75 de fijación ultrabaja que contenga 30 mililitros de medios mTeSR sin bFGF. Al día siguiente, incline el matraz de tal manera que las celdas vivas se a bolsa en la esquina.
Si hay un gran número de células que se han adherido a la parte inferior del matraz, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir las células a un nuevo matraz. Espere tener una alta población de células muertas durante los primeros días. Una vez que las células se asienten, aspirar a los medios y células muertas dejando alrededor de 10 mililitros de medios que contienen las células vivas y añadir 20 mililitros de medios bajos de bFGF complementados con 30 nanogramos por mililitro de bFGF.
Después de dos días, revisa las celdas. La mayoría de las células deben verse sanas y brillantes. Sin embargo, si más de un tercio de las células aparecen oscuras, incline el matraz y reemplace 20 mililitros de medios por 20 mililitros de medios bFGF bajos complementados con 20 nanogramos por mililitro de bFGF.
En el tercer día, retire la mitad de los medios y sustitúyalos con 15 mililitros de medios hESC complementados con 10 nanogramos por mililitro de bFGF. En el quinto día, reemplace la mitad de los medios con 15 mililitros de medios de inducción neuronal. Después de eso, cada dos días, reemplace la mitad del medio con medios de inducción neuronal.
Después de tres semanas en el cultivo, añadir 100X Penicilina-Estreptomicina a los medios a una concentración final de 1X si se desea. Refresque la mitad de los medios cada dos días. En este protocolo, los organoides cerebrales formados se veían brillantes y de tamaño similar sin células oscuras moribundas en los centros de estos grupos.
Las células fueron gradualmente destetados de bFGF. En el quinto día, fueron colocados en medios de inducción neuronal y permanecieron en este medio durante todo el período de cultivo. Aunque los organoides se hizo más grandes y por lo tanto más oscuros con el tiempo, las estructuras similares a la roseta neural se expandieron lo que indica el inicio de la diferenciación neuronal y contiene características del tubo neural embrionario.
Para examinar más en profundidad la expresión génica dentro de las células, se realizó un análisis de qPCR. El transportador de glutamato VLGUT1 se expresó a las dos semanas y media, aumentó a las cinco semanas y se mantuvo constante durante cinco meses de cultura. Un marcador de antebrazado Foxg1 se expresó en niveles bajos hasta cinco semanas en el cultivo.
El marcador de capa profunda Tbr1 alcanzó su punto máximo alrededor de cinco semanas y disminuyó posteriormente. Mientras que la expresión del marcador de capa superior Satb2, el marcador ventral Eng1, el marcador de la médula espinal hindbrain Hoxb4, así como el marcador de oligodendrocitos Olig2 aumentaron con el tiempo. Por el contrario, el marcador de células madre Sox2 disminuyó con el tiempo.
El marcador glial GFAP alcanzó su punto máximo en cinco semanas y se mantuvo relativamente constante posteriormente. Recuerda tener el máximo cuidado al manipular las células ES en los organoides de la etapa temprana para evitar la contaminación a medida que se cultivan sin antibióticos y también recuerda alimentarse según el horario. Después de este procedimiento, puede evaluar los organoides utilizando técnicas como la RT-PCR cuantitativa para la expresión génica y la inmunofluorescencia para la expresión y localización de proteínas.
Usando esta técnica, pudimos estudiar la capacidad de una molécula pequeña para aliviar aspectos de la lesión hipoxica neonatal humana como se modela en una cámara de hipoxia. Es significativo que estos organoides cerebrales humanos se comportaron de manera similar a los experimentos de ratón in vivo.
