ويبين بروتوكولنا أن إدارة المحتوى في المحتوى قد تعزز التمايز الادجيني في غياب وسطاء تقليديين من الوسطاء التقليديين، وهي أول من يثبت تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي الخاص بالأمراض من قبل إدارة المحتوى في الجسم. لدينا تقنية يوفر أداة لتشريح أدوار ECM وdipocytes في التمثيل الغذائي الأنسجة الدهنية ودراسة السماح لدور ECM في تنظيم التوازن الأنسجة الدهنية. بالمقارنة مع ثقافة الخلايا 2D القياسية، لدينا نموذج 3D يسمح لفحص أكثر قوة وتشريح من عبر الحديث بين الخلايا الشحمية و ECM الأنسجة الدهنية في سياق مرض السكري من النوع 2.
نوصي بداية مع عينات أصغر لقياس مدى خلوية. نضع في اعتبارنا أن هناك تقلب بين المرضى في مدى نمو الخلايا ومدى إزالة الخلايا الأنسجة. من المهم مراقبة الأنسجة قبل وبعد كل خطوة لضمان أن الأنسجة أصبحت مزيل الخلية وفهم الاختلافات المحتملة بين العينات.
بعد الحصول على الأنسجة الدهنية الحشوية أو ضريبة القيمة المضافة من الجراحة، وإعداده للتخزين عن طريق إضافة 5-10 غراما من الأنسجة إلى 15-25 ملليلتر من محلول عازلة تجميد في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. غمر العينة تمامًا وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية إلى أن يتم إزالة الخلايا. لعزل preadipocyte، ضع غرامين من عينة جديدة من ضريبة القيمة المضافة سليمة في 20 ملليلتر من الحل كولاجيناز من النوع الثاني، ثم إدراج مقص معقمة في الأنبوب ويمرم تماما الأنسجة.
مرة واحدة مفرومة إلى الطين غرامة، احتضانه في محلول الكولاجيناز في 37 درجة مئوية على شاكر المدارية لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة، تصفية الناتجة هضمها من خلال شبكة النايلون 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر الطازجة. وينبغي أن يكون هضم السائل الأصفر والبرتقالي مع اللزوجة المعتدلة وكمية صغيرة من خيوط المتبقية من الأنسجة غير مهضومة.
الطرد المركزي العينة في 270 مرات ز لمدة 10 دقائق، وإزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في مليلتر اثنين من 1X RBC حل lysing مع ماصة. احتضان الحل لمدة دقيقة واحدة في 25 درجة مئوية، ثم إضافة 10 ملليلتر من 15٪ FBS DMEM F12 والطرد المركزي في 270 مرات ز لمدة 10 دقائق. لإعداد ECM، تجميد / ذوبان عينة ضريبة القيمة المضافة المجمدة سابقا إلى 37 درجة مئوية عن طريق احتضانه في حمام مائي قبل تسخينها لمدة 20 دقيقة مع التحريض اليدوي لطيف الدورية.
بمجرد إذابة، نقل الأنسجة مرة أخرى إلى ناقص 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وتكرار عملية التجميد / ذوبان ثلاث مرات تنتهي مع ذوبان الجليد. استخدام ملقط العقيمة لنقل عينة ضريبة القيمة المضافة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر جديدة تحتوي على 15-25 ملليلتر من محلول انزيمي 1 مع التأكد من أن العينة مغمورة بالكامل. ثم احتضانه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 130 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي، قم بغسل العينة ثلاث مرات بـ 15-25 ملليلتر من محلول عازل الشطف، وصب المحلل بعد كل غسل. نقل العينة إلى أنبوب 50 ملليلتر الطازجة مع 15-25 ملليلتر من محلول انزيمي 2 واحتضانه بين عشية وضحاها. كرر يغسل مع محلول العازلة الشطف ونقل العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 15-25 ملليلتر من محلول استخراج المذيبات القطبية.
احتضان العينة بين عشية وضحاها في حين تهتز. بعد الحضانة مع المحلول المذيبات القطبية، من المهم فحص عينة لإزالة الدهون. إذا لم تتم إزالة معظم الدهون, قد يكون من الضروري تكرار هذه الخطوة.
يمكن استخدام وقت حضانة أقصر. بعد الحضانة، نقل العينة إلى أنبوب جديد يحتوي على 15-25 ملليلتر من محلول عازل الشطف وغسل العينة ثلاث مرات على شاكر. ثم غسل العينة ثلاث مرات مع 70٪ من محلول الإيثانول، وصب قبالة الإيثانول بعد كل غسل.
اغسل العينة مرة واحدة مع محلول التخزين، ثم استخدم ملقط معقمة لنقلها إلى أنبوب جديد يحتوي على 15-25 ملليلتر من حل التخزين مع التأكد من غمره بالكامل. ويمكن بعد ذلك تخزين العينة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. الإيزوبروبانول والإيثانول قابل للاشتعال ويجب أن يكون في درجة حرارة الغرفة والتخلص منها في النفايات القابلة للاشتعال.
يجب التخلص من أي نفايات بشرية بشكل منفصل عن النفايات الحية المعتادة. نقل شظايا ECM المخزنة إلى آبار فردية من لوحة 24 بئرًا مع ملقط عقيمة تضيف أكبر عدد من الشظايا كما هو مطلوب للتشقيمات المصب المخطط لها. غسلها ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول على شاكر المدارية، ثم إعادة هيدرات لهم عن طريق غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
استخدام مقص معقمة لقطع ECM إلى 100 ملليغرام شظايا. ضع كل جزء في بئر واحد من لوحة 24 بئرًا واحتضان اللوحة عند درجة 25 مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لبرنامج PBS الزائد بالبثق من الشظايا. ثم إزالة بعناية أي برنامج تلفزيوني المتبقي من الآبار مع ماصة.
بذور كل جزء مع 20 ميكرولترات من تعليق الخلية preadipocyte عن طريق الأنابيب الخلايا مباشرة في ECM. ضع طرف الماصات في ECM وطرده بلطف في وسط المصفوفة مع التأكد من أن تعليق الخلية لا يفيض وينتهي به المطاف في الجزء السفلي من البئر. إذا كان تعليق الخلية تجاوز من ECM، إزالة تلميح ماصة من ذلك الموقع وإدراجه في مكان آخر في ECM.
بعد بذر الخلية، احتضان ECM لمدة 40 دقيقة في 37 درجة مئوية. ملء كل بئر مع 500 microliters من وسائل الإعلام النمو لتغطية شظايا ECM المصنفة. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
بعد 72 ساعة، استلهم بعناية وسائل الإعلام النمو دون إزعاج جزء ECM. إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام والثقافة التمايز الخلايا لمدة 14 يوما تغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام. تحقق من التمايز باستخدام المجهر الخفيف.
الخلايا سوف تتراكم الدهون، بدوره البني والأصفر في اللون وتصبح أكثر كروية لأنها تميز. تم رصد إعداد ECM الأنسجة الدهنية، البذر مع preadipocytes، والتمايز في المختبر في adipocytes ناضجة مع المجهر الإلكتروني المسح الذي كشف إزالة الخلية من ECM وفيما بعد تلخيص الدهون التي تحتوي على الشحمية عند إعادة البذور والتمايز. الكولاجين 1 الكيمياء المناعية المحددة من ECM decellularized أظهرت الحفاظ على بنية الكولاجين الصغيرة في حين النفط الأحمر O تلطيخ من العيش وثابت 3D ECM-adipocyte بنيات أظهرت الدهون التي تحتوي على adipocytes.
تم فحص الخلايا الشحمية المتمايزة في ECM للجيناتadipogenic باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي الذي أثبت أن هذه الجينات هي أعلى تنظيما في الخلايا المختلفة نسبة إلى preadipocytes غير متمايزة مثقف في ECM. يتم عرض الفرق الكامل في مستويات النص. أربعة تركيبات من ECM وdipocytes من مواضيع السكري وغير السكري تعرضت للphenotyping الأيضية.
تم اكتشاف ضعف امتصاص الجلوكوز في وظيفة الشحمية في بنيات من الأنسجة السكري. الأهم من ذلك، وجد أن ECM غير السكري ينقذ امتصاص الجلوكوز يحفز الأنسولين وقدرة lipolytic في الخلايا الدهنية السكري. تلوث من البديبوسات المعزولة، والأنسجة ديسيلولار، و ECM reseeded ليس من غير المألوف.
يجب الحفاظ على العقم بجد في جميع أنحاء البروتوكول.
