Этот протокол полезен для определения изменений в активации NF-kappa-B в клетках, выражаюх репортер NF-kappa-B luciferase. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает высокую пропускную способность экрана факторов или условий, которые приводят к изменениям в активации NF-kappa-B. NF-kappa-B является транскрипционным фактором для широкого спектра клеточных процессов.
Хорошо известная функция NF-kappa-B заключается в индукции воспалительных реакций путем индуцирования экспрессии различных цитокинов и хемокиных. Наша лаборатория особенно заинтересована в индукции NF-каппа-B, индуцированной патогеном Salmonella typhimurium. Здесь мы используем линию клеток HeLa, которая стабилико трансфицирована плазмидной плазмидой репортера NF-kappa-B luciferase.
Другие бактерии, или даже вирусы или химические соединения, могут быть использованы в этой клеточной линии для изучения активации NF-каппа-B. Другие клеточные линии также могут быть использованы, если вы можете ввести такой NF-каппа-B люцифераза репортер плазмид в этой клеточной линии. Кто-то делает это в первый раз могут иметь проблемы правильного использования стерильной техники, которая необходима для клеточной культуры и бактериальной работы.
За день до стимуляции клеток, удалить рост средств массовой информации HeLa 57A клеток, которые были выращены примерно до 75% слияния. Вымойте клетки с одним миллилитром 0,05%трипсина EDTA. Замените еще один миллилитр трипсина ЭДТА и перенесите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
После того, как клетки были отделены от колбы, приостановить их в 10 миллилитров средств роста. Объедините 10 микролитров клеточной подвески с 10 микролитров trypan синий, пипетка вверх и вниз, чтобы смешать, и передать 10 микролитров на слайд счетчик ячейки. Подсчитайте клетки в подвеске, используя клеточный счетчик, и используйте средства роста, чтобы разбавить клетки до конечной концентрации 2,5 раза от 10 до пяти клеток на миллилитр в 50 миллилитровой конической трубки.
Перенесите 250 микролитров клеточной подвески на каждый колодец из 48-хорошо пластины. Периодически крышка и перевернуть коническую трубку, чтобы обеспечить однородную подвеску клеток. Нажмите на тарелку осторожно на стороне, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределяются в колодцах.
Перенесите пластину на 37 градусов по Цельсию в инкубаторе с углекислым газом на 5%и позвольте клеткам прикрепляться и расти в одночасье. Полоса замороженных запасов сальмонеллы на пластины LB агар для производства одиночных колоний. Перенесите пластины в инкубатор, установленный до 37 градусов по Цельсию, и позвольте на ночь рост.
На следующий день добавьте три миллилитров LB в стерильные бактериальные трубки культуры, и добавить соответствующие антибиотики в средствах массовой информации. Используя стерильную петлю прививки, выберите одну колонию из полосатых бактериальных культур и прикоснитесь к петле к средствам LB. Cap трубки после инокуляции и отказаться от петли.
Поместите трубки в трясусь инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию и 180 об /мин, а затем позволить бактериям расти в одночасье. Утром извлекаем ночные бактериальные культуры из инкубатора. Подготовка трубок для субкультуры, добавив три миллилитров свежих LB и антибиотиков.
Перенесите 30 микролитров ночной бактериальной культуры в свежеприготовленные средства массовой информации. Поместите трубки в трясущимся инкубатором при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов. После трехчасовой инкубации перенесите один миллилитр стерильного бульона LB в пластиковый кюветт, чтобы служить пустым.
Перенесите 900 микролитров LB в другие кюветы, которые будут использоваться для анализа образца. Передача 100 микролитров бактериальной субкультуры в кювет, содержащий 900 микролитров LB, и пипетки вверх и вниз несколько раз смешивать. Повторите это для каждой бактериальной суспензии.
Включите спектрофотометр для измерения оптической плотности бактериальных культур на длине волны 600 нанометров. Поместите пробел в спектрофотометр. Примите к сведению ориентацию.
Закройте крышку и нажмите пустую кнопку на спектрофотометре, чтобы получить фоновое поглощение. Замените чистый кюветт с образцом cuvette в той же ориентации и нажмите читать. Запись значений OD600 этих образцов.
Умножьте значение на 10 для учета фактора разбавления. Разбавить подвеску от одного до 10 в кювет и измерить абсорбцию, которая должна дать значение примерно 0,1, что примерно соответствует один раз 10 до девяти CFU на миллилитр. В новой трубке добавьте соответствующий объем разбавленной субкультуры в свежий LB, чтобы добиться приостановки один раз 10 до восьми CFU на миллилитр, которые будут использоваться в качестве инокулума.
Подготовка серийных разбавления инокулума путем передачи 50 микролитров бактериальной суспензии в трубку, содержащую 450 микролитров стерильных PBS до окончательного разбавления около 100 CFU на миллилитр делается. Перенесите 100 микролитров двух самых низких разбавлений, 100 и 1000 CFU на миллилитр, на две пластины Агара LB, и распределит подвеску с помощью распространителей клеток для получения одиночных колоний. Перенесите эти пластины в инкубатор по Цельсию на 37 градусов по Цельсию и инкубировать на ночь.
На следующий день подсчитайте колонии и рассчитайте бактериальную концентрацию исходного инокулума, чтобы определить фактическую концентрацию инокулума. В тот же день, этикетка крышку пластины в соответствии с инфекционными условиями, которые будут использоваться для каждого хорошо, с каждым условием делается в трижды. Добавьте 10 микролитров инокулума в соответствующие скважины и добавьте 10 микролитров стерильных ЛБ в неинфицированные контрольные скважины.
Чтобы синхронизировать время заражения, поместите пластину в центрифугу столешницы и вращайся при 500 раз G в течение пяти минут, гарантируя, что пластина уравновешивает. Затем перенесите инфицированные клетки в инкубатор двуокиси углерода на 5% при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Поместите 15 миллилитров конической трубки, содержащей aliquot клеточной культуры средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию водяной бане для использования в следующем шаге.
Через час после времени заражения, удалить 15 миллилитров конической трубки, содержащей клеточной культуры средств массовой информации из водяной бани и протрите внешний с 70% этанола. Перенесите пластины культуры тканей из инкубатора в шкаф для биобезопасности. Используйте стерильные советы, чтобы аспирировать средства массовой информации из колодцев и заменить 250 микролитров свежих, теплых средств культуры клеток.
Верните пластины в инкубатор двуокиси 5%carbon при 37 градусах По Цельсию в течение еще четырех часов. После этого удалите пластины из инкубатора углекислого газа и аспирировать средства массовой информации из скважин. Для анализа люциферазы добавьте в скважины 100 микролитров буфера лиза 1X клеток.
Перенесите пластину в отрицательную морозильную камеру на 80 градусов по Цельсию и инкубировать в течение по крайней мере 30 минут, чтобы обеспечить эффективный лиз клеток. Затем поместите пластину, содержащую лизат замороженных клеток, на скамейку, чтобы оттаять, и приготовьте субагенты люциферазы в соответствии с рекомендациями производителя. Разрешить люциферазы субстрат реагентов для равновесия до комнатной температуры.
Затем включите считыватель пластин и откройте соответствующую читательской программы. Установите машину для измерения люминесценции. Перенесите 10 микролитров каждой ячейки лизай в колодец непрозрачной пластины из 96 колодец.
Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 микролитров реагента анализа люциферазы в каждую колодец непрозрачной пластины. Аккуратно коснитесь пластины на стороне, чтобы смешать скважины, и убедитесь, что нижняя поверхность покрыта жидкостью. Поместите тарелку в считыватель пластин и инициировать чтение.
Скопируйте значения люминесценции в программу электронной таблицы и свястиируйте результаты. Этот протокол фокусируется на активации транскрипционные факторы NF-kappa-B с помощью NF-каппа-B зависимых люцифераза репортер, который ножом трансфицированы в линию клеток HeLa. На этом рисунке показан репрезентативный эксперимент NF-kappa-B зависимой активации люциферазы и экспрессии гена IL6 в клетках HeLA 57A, инфицированных штаммами salmonella typhimurium.
Инфекция с диким штаммом типа SL1344 индуцированных сильный сигнал люциферазы в обоих RLU и IL6 выражение, которое было уменьшено в клетках, инфицированных sipA sopB sopE2 тройной мутант и сводится к контролю уровней с sipA sopB sopE2 sopE четырехместный мутант. Обратите пристальное внимание при выполнении серийных разбавлений и покрытия. Это гарантирует, что у вас есть последовательный inoculum через ваши штаммы.
После выявления факторов, способствующих активации NF-kappa-B и изменениям в экспрессии мРНК, западный метод помарки может быть использован для выявления изменений в экспрессии белка. Этот протокол позволил нашей лаборатории не только оценить активацию NF-kappa-B, вызванную сальмонеллой, но и другие соединения и белки, замешанные в активации NF-kappa-B. Сальмонеллы typhimurium является патогеном человека.
И использовать надлежащее СИЗ при работе с этими бактериями.
