غشاء وجدار الخلية الأصباغ الفلورية الانتقائية هي أدوات هامة لتحليل ديناميات العضية والخلايا الفطرية الحية. توفر بروتوكولاتنا الخلفية النظرية الأساسية والمبادئ التوجيهية العملية لتطبيق مجموعة مختارة من هذه الأصباغ كبقع حيوية حقًا. النقطة الرئيسية لهذا هو استخدام تركيزات صبغ منخفضة جدا التي لا تسبب التحف الخلوية المتعلقة التشبع أو سمية الصبغة في حين لا تزال توفر إشارة جيدة إلى نسب الضوضاء ل عالية الجودة، على المدى الطويل التصوير الخلية الحية.
مع زملاء من قسم الطب النووي في الجامعة الطبية، استخدمنا مؤخرا هذه التقنيات تلطيخ لتطوير نهج جديد لتشخيص الصورة الموجهة من aapergillosis. كانت القدرة على مراقبة الأغشية والخلايا هياكل الجدار في الوقت الحقيقي حاسمة لتحديد ديناميات امتصاص مركب المخدرات التجريبية. لبدء هذا الإجراء، أولا الحصول على زراعة سابقة معدة.
استخدام مشرط معقم لقطع كتلة أجار الصغيرة التي تحمل النخاع غير sporulating من حافة مستعمرة من قبل زراعة. ضع كتلة أجار في وسط لوحة متوسطة جديدة صلبة لتطعيم الثقافة التجريبية. احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية المزمع احتضانها.
إعداد العينة هو دقيق إلى حد ما والتحسين من إعدادات الحصول على الصور هو معقد نوعا ما. عرض مرئيّة من كلا إجراءات يصحب مع شرح لفظيّة إلى حدّ بعيد يسهّل قابلية تكرار. لتركيب العينات، والحفاظ على نظيفة 24 من 60 ملليمتر غطاء زجاجي زلة جاهزة وإضافة 18 ميكرولترات من السائل الحد الأدنى من حل الملح المتوسطة أو الفسيولوجية على المركز.
إضافة اثنين microliters من 20 صبغة 20 صبغة صغيرة مستعدة حل العمل إلى السائل في وسط زلة الغطاء ومزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات مع تجنب إنتاج فقاعات الهواء. باستخدام مشرط نظيف ، قطع عينة 15 في 15 ملليمتر من محيط المستعمرة ووضعها عموديا بجانب قطرة المتوسطة على زلة الغطاء. استخدم المشرط لدعم الحافة العليا للكتلة وإصبعك ليمسك الجانب الخلفي للكتلة في مكانه.
ثم، ببطء خفض الجانب تحمل الميسيليوم على السائل. جبل العينة المعدة على مرحلة المجهر. أولاً، ضبط إعدادات الحصول على الصور الأساسية لالتقاط الديناميات الدائمة في hyphae الفردية كما هو موضح في بروتوكول النص.
للحصول على المقايسات امتصاص endocytosis، راجع الشكل الأول والجدول واحد من بروتوكول النص لتحديد أفضل الإثارة وإعدادات الانبعاثات لFM 143 أو FM 464 التي تتوفر على نظام المجهر وضبط هذه الإعدادات في النظام وفقا لذلك. ابدأ تسجيل الصور باستخدام الإعدادات المعدلة مسبقًا وقيّم النتائج. ثم، تحسين إعدادات الحصول على الصورة إلى الدقة المكانية والزمانية المطلوبة لالتقاط جانب من غشاء البلازما أو ديناميات بطانة الرحم تركز التجربة على.
لديناميات جدار الخلية، والتشاور مع الشكل الرابع والجدول واحد من بروتوكول النص لتحديد أفضل الإثارة وإعدادات الانبعاثات لصبغ جدار الخلية التطبيقية وضبط الإعدادات على نظام المجهر وفقا لذلك. ابدأ تسجيل الصور باستخدام الإعدادات المعدلة مسبقًا وقيّم النتائج. ثم، تحسين إعدادات الحصول على الصورة إلى القرار المكاني والزماني المطلوب لالتقاط جانب من morphogenesis جدار الخلية تركز التجربة على.
بالإضافة إلى مجرد تصور العمليات الخلوية ، والتصوير الخلية الحية يسمح استخراج المعلومات الكمية من البيانات المسجلة. في مثال على مقايسات 464 FM امتصاص، تزرع عينات الفطريات كمستعمرات والتي شنتها طريقة كتلة أجار المقلوبة. حددت الأقوال عيوبًا في التنظيم الزقاقي الزماني للاندوسيت في حذف الجينات والمتحولات المفرطة في التعبير عن المسوخ من البروتين الفطري المحدد SFP 2 من trichoderma atroviride.
تظهر هنا أمثلة على 464 FM شارك في تلطيخ بروتينات الانصهار الفلورسنت التي تستهدف مقصورات endocytic. يتم استخدام هذا التلطيخ المشترك لربط التوزيع دون الخلوي لبروتيني الفلورسنت الأخضر المعززين الموسومين عبر السيمبران، SFP 2 و GPR 1، إلى المسار endocytic في trichoderma atroviride. مثال على FM 464 شارك في تلطيخ لتحديد الاختلافات المورفوجينيك يبين أن هذا التلطيخ المشترك يسمح بمزيد من العلاقة بين ديناميات التعريب دون الخلوية من البروتين المعقد BUD-6 القطبية المسمى بشكل كبير لإنهاء بعض العمليات المعتمدة على الاتجار مثل تشكيل سيبتا ونمو طرف الواصلة المستقطب.
كما أنه يميز الاختلافات في التنظيم دون الخلوية والهندسة المعمارية الواصلة بين النوع البري وسلالات متحولة من الكريسا neurospora. ممثل خلية الجدار الملون يظهر أن خصائص التفاعل المختلفة من الكالفورو الأبيض، solophenyl فلافين، والكونغو الحمراء مع البوليمرات جدار الخلية تسليط الضوء على الاختلافات المورفونيكية بين دلتا SFP 2 متحولة وسلالة نوع البرية من trichoderma atroviride. زيادة ضغط جدار الخلية التي تسببها تركيزات صبغ مرتفعة يحدث بسرعة أكبر وأكثر وضوحا في متحولة بالمقارنة مع نوع البرية.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن نفس الصور تسمح بالتقويم الكمي للاختلافات المورفوجينية فيما يتعلق بقطر الواصلة والمسافة الحاجزية بين كل من السلالات. رصد تمثيلي في الوقت الحقيقي من الخلية الجدار البيولوجي يشير إلى أن تركيز منخفض جدا calcofluor الأبيض يمنع تشبع جدار الخلية مع جزيئات الصبغة ويسمح الرصد الحقيقي الكمي من التركيب الحيوي جدار الخلية. وهذا يكشف عن أن ترسب مادة جدار الخلية الجديدة ليست موحدة، ولكن يستجيب بسرعة كبيرة للضغوط الجسدية المترجمة الناتجة عن التشريد النسبي لخلية واحدة على مرفق خلية إلى خلية قبل أن الوهن في الاعصاب في البور.
أقل هو أكثر. استخدام صبغة أقل قدر ممكن لمنع تدخل علامة الفلورسنت مع العمليات الخلوية. وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء عملية استعادة دقيق بعد تجارب تبييض الصور لتحديد مقدار حركة النقل والنشوء البيولوجي.
إن الإدخال الرائد للغشاء وجدار الخلايا الذي يلطخ الفطريات الخيطية في بداية الألفية أحدث ثورة في الطريقة التي ننظر بها إلى الفطريات. يمكن أن يسبب الكالكوفلور الأبيض تهيج العين وهو سرطانية مصنفة. الكونغو الحمراء هو سرطاني ومسخ، لذا يرجى ارتداء العين وحماية الجلد عند التعامل مع هذه الأصباغ.
