Corantes fluorescentes seletivos de membrana e parede celular são ferramentas importantes para a análise da dinâmica organela e das células fúngicas vivas. Nossos protocolos fornecem fundamentais de fundo teórico e diretrizes práticas para a aplicação de uma seleção desses corantes como manchas verdadeiramente vitais. O ponto chave para isso é usar concentrações de corante muito baixas que não causam artefatos celulares relacionados à saturação ou toxicidade de corantes, ao mesmo tempo em que fornecem boas relações de sinal para ruído para imagens de células vivas de alta qualidade e de longo prazo.
Com colegas do Departamento de Medicina Nuclear da universidade médica, recentemente usamos essas técnicas de coloração para desenvolver uma nova abordagem para o diagnóstico guiado por imagens da aapergillose. A capacidade de monitorar estruturas de membrana e parede celular em tempo real foi crucial para determinar a dinâmica de absorção do composto experimental da droga. Para iniciar este procedimento, primeiro obtenha uma pré-cultura preparada.
Use um bisturi estéril para cortar um pequeno bloco de ágar que carrega micélio não esporulento da borda da colônia da précultura. Coloque o bloco de ágar no centro de uma placa média fresca e sólida para inocular a cultura experimental. Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser incubado.
A preparação da amostra é um pouco delicada e a otimização das configurações de aquisição de imagens é bastante complexa. A demonstração visual de ambos os procedimentos acompanhados de explicação verbal facilita muito a replicabilidade. Para montar as amostras, mantenha um deslizamento limpo de 24 por 60 milímetros de tampa de vidro pronto e adicione 18 microliters de solução líquida de sal médio ou fisiológico no centro.
Adicione dois microliters da solução de trabalho de 20 micromolares preparados ao líquido no centro da tampa e misture bem, encobrindo e descendo várias vezes, evitando a produção de bolhas de ar. Usando um bisturi limpo, corte uma amostra de 15 por 15 milímetros da periferia da colônia e coloque-a verticalmente ao lado da gota média no deslizamento da tampa. Use o bisturi para apoiar a borda superior do bloco e um dedo para segurar a parte traseira do bloco no lugar.
Em seguida, abaixe lentamente o lado carregando o micélio para o líquido. Monte a amostra preparada no estágio do microscópio. Primeiro, ajuste as configurações básicas de aquisição de imagens para capturar dinâmicas permanentes em hifas individuais, conforme descrito no protocolo de texto.
Para os ensaios de absorção da endocitose, consulte a figura um e a tabela um protocolo de texto para identificar as melhores configurações de excitação e emissão para FM 143 ou FM 464 que estão disponíveis no sistema de microscopia e ajustar essas configurações no sistema em conformidade. Inicie a gravação de imagens usando as configurações previamente ajustadas e avalie os resultados. Em seguida, otimize as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da membrana plasmática ou da dinâmica da endocitose em que o experimento está focado.
Para a dinâmica da parede celular, consulte a figura quatro e a tabela um protocolo de texto para identificar as melhores configurações de excitação e emissão para o corante da parede celular aplicada e ajustar as configurações do sistema de microscopia em conformidade. Inicie a gravação de imagens usando as configurações previamente ajustadas e avalie os resultados. Em seguida, otimize as configurações de aquisição de imagem para a resolução espacial e temporal necessária para capturar o aspecto da morfogênese da parede celular em que o experimento está focado.
Além de apenas visualizar processos celulares, a imagem celular viva permite a extração de informações quantitativas a partir dos dados registrados. Em um exemplo dos ensaios de absorção FM 464, as amostras fúngicas são cultivadas como colônias e montadas pelo método de bloco de ágar invertido. Os ensaios identificaram defeitos na organização espócica-temporal da endocitose na exclusão genética e mutantes super-expressantes genéticos da proteína específica fúngica SFP 2 do trichoderma atroviride.
Exemplos de fm 464 co-coloração de proteínas de fusão fluorescente direcionadas a compartimentos endocíticos é mostrado aqui. Esta co-coloração é empregada para relacionar a distribuição subcelular das duas proteínas fluorescentes verdes aprimoradas marcadas proteína transmembrana, SFP 2 e GPR 1, à via endocítica no trichoderma atroviride. Um exemplo de co-coloração FM 464 para a identificação de diferenças morfogenéticas mostra que essa co-coloração permite uma maior relação com a dinâmica de localização subcelular da proteína do polarismo BUD-6 rotulada para o fim de alguns processos dependentes do tráfico, como a formação de septa e crescimento de pontas de higifismo polarizada.
Também caracteriza diferenças na organização subcelular e arquitetura hiphal entre tipo selvagem e cepas mutantes de crassa neurospora. A coloração representativa da parede celular mostra que as diferentes propriedades de interação do branco calcofluor, flavine solofenil e vermelho congo com polímeros de parede celular destacam diferenças morfogenéticas entre o mutante delta SFP 2 e a cepa do tipo selvagem de trichoderma atroviride. O aumento do estresse da parede celular infligido por concentrações elevadas de corante ocorre mais rapidamente e é mais pronunciado no mutante em comparação com o tipo selvagem.
Além disso, as mesmas imagens permitem a quantificação de diferenças morfogenéticas em relação ao diâmetro hifál e distância septal entre ambas as cepas. O monitoramento representativo em tempo real da biossíntese da parede celular indica que a concentração branca de calcofluor muito baixa impede a saturação da parede celular com moléculas de corante e permite o monitoramento quantitativo em tempo real da biossíntese da parede celular. Isso revela que a deposição de novo material de parede celular não é uniforme, mas responde muito rapidamente a tensões físicas localizadas resultantes do deslocamento relativo de uma célula sobre o apego célula-célula antes da dermalinfusão na crassa neurospora.
Menos é mais. Use o mínimo de corante possível para impedir a interferência do marcador fluorescente com processos celulares. Após este procedimento, a recuperação da flourescência após experimentos de branqueamento fotográfico poderia ser realizada para quantificar o transporte e a cinética da biogênese.
A introdução pioneira da coloração da membrana e da parede celular em fungos filamentosos no início do milênio literalmente revolucionou a maneira como olhamos para os fungos. Calcofluor branco pode causar irritações oculares e é um cancerígeno classificado. O vermelho congolês é cancerigênico e teratogênico, por isso, por favor, use proteção ocular e de pele ao manusear esses corantes.
