هذه الطريقة تتعقب الهياكل في خلايا الخميرة في ثلاثة أبعاد على مدى عدة دقائق ، مما يسمح لنا بدراسة ديناميات العضيات داخل الخلايا والمقصورات. يضمن التصوير رباعي الأبعاد أن نتمكن من استخلاص استنتاجات موثوقة حول الديناميات داخل الخلايا، خاصة بالنسبة للهياكل أو العلامات التي قد تكون عابرة. إثبات الإجراء سيكون ناتالي جونسون، ما بعد الدكتوراه من مختبري.
تبدأ من خلال زراعة ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة من الاهتمام في خمسة ملليلتر من الاصطناعية غير الفلورية المحددة، أو NSD، المتوسطة، في قارورة 15 ملليلتر حائرة مع تهوية جيدة، في 23 درجة مئوية. قبل ثلاث إلى أربع ساعات من التحليل، تمييع ثقافة الخميرة المرحلة اللوغاريتمية في وسط NSD الطازجة، بحيث تكون الكثافة البصرية النهائية في 600 نانومتر، أو OD600، 0.5 إلى 0.8 في وقت التصوير. على الأقل ساعة واحدة قبل الثقافة جاهزة، وأجهزة الطرد المركزي aliquot من اثنين ملليغرام لكل ملليلتر Concanavalin A حل لمدة خمس دقائق بأقصى سرعة، ل بيليه أي الجسيمات، وإضافة 250 ميكرولترات من الماغنات إلى نظيفة 35 ملليمتر الزجاج أسفل طبق المجهر.
بعد 15 دقيقة، اغسل الطبق مرتين إلى ثلاث مرات بمليلترين من الماء المقطر لكل غسل، إضافة 250 ميكرولترات من ثقافة الخميرة إلى الطبق المغلف بالكونكافانافلين A بعد تجفيفه. انتظر 10 دقائق للسماح للخلايا بالتمسك ، قبل غسل الطبق برفق مرتين إلى ثلاث مرات أخرى مع ملليلترين من وسط NSD الطازج. ثم تغطية الخلايا مع مليلتر اثنين من NSD جديدة.
لتصوير خلايا الخميرة، حدد عدسة غمر الزيت 63X مع فتحة رقمية لا تقل عن 1.4 على مجهر خفيف. هنا ، يمكن أيضا عدسة الهدف 100X يمكن استخدامها بدلا من عدسة الهدف 63X. ثم، ضع الطبق على العدسة الموضوعية، التي تم رصدها مع زيت الغمر.
من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب وضع الاكتساب، حدد xyzt. تحت علامة التبويب س ص، قم بتنسيق حجم الإطار إلى 256 عرض بواسطة 128 ارتفاع. استخدم السرعة القصوى للمسح الضوئي، والتي عادةً ما تكون على أساس ثمانية كيلوهيرتز.
قم بتشغيل المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه إذا كان متوفراً، وضبط عامل التكبير إلى 9، مما سيؤدي إلى حجم بكسل يبلغ حوالي 80 نانومتر. إذا تم استخدام هدف 100X، ضبط عامل التكبير وفقاً لذلك للحفاظ على حجم بكسل من 80 نانومتر تقريباً. ثم تعيين تراكم الخط إلى أربعة أو ستة.
تعيين الثقب إلى 1.2 وحدات هوائية، وتشغيل الليزر الضوء الأبيض، إذا كان متوفرا. ثم تعيين الطول الموجي الإثارة وقوة الليزر في المئة لكل قناة الفلوريسنس. إذا كان متوفراً، قم بتمكين استخدام وضع العد الضوئي تحت علامة تبويب التكوين عن طريق إلغاء تحديد الحد الأقصى لوقت التكامل.
لكل قناة من قنوات الفلوريسين، قم بتعيين جهاز كشف حساسية عالية، وتعيين نطاق الطول الموجي للانبعاثات، وتشغيل وضع العد الضوئي، إذا كان ذلك متاحًا. تعيين نافذة توقيت البوابات إلى 0.6 إلى 10 نانو ثانية لكل قناة الفلوريسين، لتجنب التقاط الضوء المنعكوس من الطبق الزجاجي. بعد ذلك، قم بتشغيل التصوير الميداني الساطع، وحدد جهاز كشف الحساسية المنخفضة لجمع البيانات.
قم بتشغيل وضع التصوير المباشر، ثم قم بتشغيل المكسب في قناة الحقل الساطع حتى تصبح الخلايا مرئية بوضوح. إذا كان في وضع العد الفوتون، قم بتغيير نطاق القيم الرمادية من يدوي إلى تلقائي لعرض إشارة الفلورسنت. تعيين Z-المكدس لصورة حجم كامل من خلايا الخميرة وتحديد اتجاه التصوير بحيث تتحرك لأسفل نحو زلة الغطاء.
تعيين الفاصل الزمني الخطوة Z إلى 0.25 إلى 0.35 ميكرومتر للحصول على حوالي 20 إلى 25 المقاطع البصرية لكل Z المكدس، وتشغيل تدفق Galvo إذا كان متوفراً. بالنسبة لفيلم نموذجي، قم بتعيين الفاصل الزمني بين مكدسات Z إلى ثانيتين، ثم قم بتعيين مدة الفيلم إلى خمس إلى 10 دقائق. ثم احفظ الفيلم كملف LIF.
لdeonvolution الفيلم، إطلاق برنامج فك التشفير المناسبة التي تستخدم خوارزمية التقدير الاحتمال الأقصى الكلاسيكية، وفتح سلسلة البيانات. حدد معالج deconvolution ومحرر المعلمة للتأكد من الكشف عن معلمات التصوير وعرضها بشكل صحيح. تغيير قيمة معامل الانكسار المتوسطة المضمّنة إلى 1.4 إلى تقريبية السيتوبلازم الخميرة.
ثم استخدم المحرر لتقدير موضع قسيمة الغلاف. حدد تعيين الكل الذي تم التحقق منه، ثم انقر فوق قبول، وحدد أدخل المعالج. انقر فوق السهم التالي لتجاوز تحديد وظيفة انتشار النقطة واقتصاص مراحل المعالجة المسبقة، ثم انتقل خلال معالج إلغاء الفبركة لكل قناة من قنوات الفلوريسنس.
حدد دالة تعيين اللوغاريتمية اللوغاريتمية الرأسية وفحص ملف تعريف كثافة الفلورسنسيات الأولية للبيانات. تعيين يدوي كوضع لتقدير الخلفية، وأدخل قيمة خلفية، وانقر فوق قبول. اترك قيمة الحد الأقصى للتكرار عند 40 وأدخل نسبة إشارة إلى ضوضاء مقدرة.
ثم قم بإيقاف تشغيل تصحيح التبييض، ثم انقر فوق Deconvolve. حدد قبول إلى القناة التالية في نافذة نتيجة deconvolution، إذا تمت إزالة الضوضاء بشكل كاف دون إزالة الفلوريس حقيقي من الهياكل خافتة. بمجرد أن يتم إلغاء تفكيك جميع القنوات الفلورسنت بشكل مرضٍ ، انقر فوق All done وترتيب القناة الحمراء أولاً ، تليها قنوات الحقل الأخضر والأزرق ومشرق ، للتحرير اللاحق في ImageJ.
ثم حفظ تسلسل الصورة كملف TIF ثمانية بت وحدد ملف واحد لكل قناة والتباين تمتد كوضع التحويل. لتصحيح التبييض، قم باستيراد تسلسلات الصورة deconvolved إلى ImageJ وانقر فوق ImageJ، Hyperstacks، و Stack إلى Hyperstack لتحويل الصور إلى كومة هد. حدد xyzct من القائمة المنسدلة وأدخل عدد القنوات وشرائح المكدس Z والإطار الزمني.
لتصحيح قنوات الفلوريسنس لتبييض الصور، حدد الصورة، اللون، قنوات الانقسام، والقنوات الفلورية، حدد الإضافات، EMBLtools، تصحيح التبييض، وتناسب الأسي. ثم حدد الصور واللون وقنوات دمج لدمج حقل مشرق وتبييض قنوات الفلورانس تصحيحها في كومة الذاكرة المؤقتة ، وحفظ الهايبركوم تصحيح deconvolved والتبييض لتوليد الفيلم اللاحقة والتحرير كملف TIF ثمانية بت. لتحويل مجموعة البيانات المصححة deconvolved والتبييض إلى مونتاج متحجيم ، حدد الإضافات ، IJ_Plugins ، وجعل سلسلة المونتاج ، وحدد الهايبركست ثمانية بت ذات الصلة.
انقر فوق فتح و موافق لقبول أن جميع الشرائح سيتم استخدامها لإنشاء المونتاج، وانقر فوق موافق مرة أخرى لقبول قيمة عامل مقياس المقترحة. حفظ المونتاج الأصلي كملف TIF بت ثمانية وحدد الإضافات، IJ_Plugins، سلسلة المونتاج إلى Hyperstack و OK، لإنشاء هايبركاك 4D من المونتاج الأصلي الذي يتضمن كل الأطر الزمنية. لإنشاء الفيلم الأصلي متوسط المتوقعة، حدد أولا الإضافات، IJ_Plugins، مشروع هايبرستاك، و OK، لقبول المعلمات الافتراضية ZProjection.
حفظ متوسط الفيلم المتوقعة كملف TIF ثمانية بت وفحص الفيلم لتحديد الهياكل الفردية التي يمكن تعقبها لمدة فترة وضع العلامات الخاصة بهم. إن تحديد بنية يمكن تعقبها بشكل موثوق طوال مدة الفيلم، وعزل هذا الهيكل للتحليل، هما أهم الخطوات في الإجراء. ثم اتبع التعليمات في دليل المستخدم المساعد، لعزل هياكل الفائدة من خلال تحرير المونتاج.
إنشاء هايبركاك 4D من المونتاج تحريرها للفترة بما في ذلك هياكل الفائدة، وحفظ هايبركاك تحريرها. لتحديد كثافة الفلوريسانس مع مرور الوقت للهيكل المعزول في كومة الذاكرة المؤقتة رباعية الأبعاد المحررة، حدد الإضافات، IJ_Plugins، و تحليل الفيلم المحرر، أدخل الفاصل الزمني بين رصات Z، وانقر فوق موافق. لإنشاء فيلم نهائي للبنية المعزولة، حدد الإضافات IJ_Plugins و Project Hyperstack، حدد شرائح مكدس Z التي يجب تضمينها، حدد متوسط الكثافة كنوع الإسقاط، وانقر فوق موافق. لإنشاء كومة 4D مع البيانات الأصلية عبر البيانات المحررة ، حدد الإضافات ، IJ_Plugins ، دمج اثنين من Hyperstacks ، والمكان أولاً فوق الثانية. لإنشاء فيلم من الـ 4D مع البيانات الأصلية عبر البيانات المحررة، حدد الإضافات IJ_Plugins و Project Hyperstack، حدد شرائح مكدس Z التي يجب تضمينها، حدد متوسط الكثافة كنوع الإسقاط، وانقر فوق موافق. هنا، يمكن مقارنة الإطار الأول من إسقاط Z-المكدس من البيانات الخام إلى نفس deconvolved وتبييض تصحيح البيانات.
هذه الإطارات من نفس deconvolved والتبييض الفيلم تصحيحها تظهر اثنين من cisternae التي تم تحليلها، والتي التسمية الأولى مع الأخضر فانادايت المقاومة جليكوسيل البروتين 4 أو علامة Vrg4، وفي وقت لاحق مع الإفراز الأحمر 7 أو Sec7 الجينات علامة البروتين النقل. هذا المونتاج، التي أنشئت من فرط التبييض deconvolved وتصحيحها، ويبين جميع المقاطع البصرية في نقطة زمنية واحدة قبل وبعد التحرير، للسماح لعزل إشارة من واحدة من cisternae المختار. في هذا الشكل، تظهر عدة إطارات من الفيلم النهائي من مداخن Z المتوقعة مع الإسقاطات الأصلية في الجزء العلوي من الشكل والإسقاطات المحررة في الجزء السفلي.
ويكشف القياس الكمي للإشارات الفلورية الخضراء والحمراء من الـ Golgi cisternae المختار أن علامة Vrg4 الخضراء تصل وتستمر لمدة 80 ثانية ، وبعد ذلك ، تصل علامة Sec7 الحمراء وتستمر لمدة 60 ثانية ، مع تداخل قصير بين العلامتين. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحديد الهياكل التي يمكن تتبعها بشكل واضح طوال فترة حياتهم. يمكن إجراء نفس النوع من التحليل بعد إجراء طفرة أو نوع آخر من الانزعاج المحدد.
وقد فتحت هذه التقنية الطريق لدراسة السلوك الديناميكي للGolgi cisternae و endoplasmic مواقع الخروج من شبكة الإنترنت باستخدام الخميرة كنظام نموذجي.
