يوفر هذا البروتوكول منهجية موحدة لإعداد ومعالجة الأنسجة العضلية في بيئات ما قبل السريرية والتجارب السريرية، وهو أمر مهم للحصول على نتائج موثوقة داخل مجال DMD. التقنيات ذات الصلة لoutout تخطي exon لDD. والميزة الرئيسية هي أنها راسخة وقابلة للتكرار إذا نفذت بشكل جماعي.
وتركز هذه التقنيات أساسا على تخطي exon في DMD، ولكن مع تغيير التمهيديات، يمكن تطبيق نفس التقنيات على الأمراض الأخرى المعالجة مع العلاجات الربط. ويمكن استخدام هذه الأساليب لتحقيق exon تخطي كفاءة على حد سواء وRNA والبروتين. لإعداد عينة للتحليل ، خلط أول كميات متساوية من اللثة والمياه tragacanth حتى يصبح اللثة لينة ولزجة.
تحميل هذا الخليط في 25 ملليلتر الحقن والاستغناء 0.5 إلى سنتيمتر واحد من العلكة على أقراص الفلين الفردية. تسمية الأقراص على الجانب الآخر ووضع حاوية من إيسوبنتان في النيتروجين السائل حتى يتجمد بعض السائل. ضع كل عينة في العلكة tragacanth على الأقراص مع محور طولي لكل عمودي العضلات على الفلين.
ضع العلكة في قاع كل عضلة للمساعدة في الإمساك بالعضلات في مكانها ، واستخدم الملاقط لتجميد العينات في الهزوبين الباردة. نقل العينات بشكل مستمر لمدة دقيقة واحدة أو حتى المجمدة تماما قبل وضعها مؤقتا على الجليد الجاف. ثم ضع العينات في قارورة زجاجية للتخزين 80 درجة مئوية.
لقسم الأنسجة العضلية المجمدة للتحليل، تعيين التبريد إلى درجة حرارة العمل من 25 درجة مئوية، وتركيب كتلة العضلات على حامل. تقليم كتلة الأنسجة حتى يتم تحقيق أقسام مسطحة. للحصول على نسخ عكسية PCR وتحليل البقعة الغربية، والحصول على شرائح سميكة 10 ميكرومتر.
للتحليل المناعي الكيميائي، والحصول على ستة إلى ثمانية شرائح ميكرومتر سميكة، ولالطومة الاوزلين وتلطيخ، والحصول على شرائح سميكة 10 إلى 12 ميكرومتر. بعد اكتسابها، ضع الأجزاء المقطعة في أنبوبين مليلترين. تخزين العينات لPCR وغرب النشاف في 80 درجة مئوية.
هنا، يتم عرض نظام electrophoresis رقاقة، صور هلام من ردود الفعل النسخ العكسي PCR، ونتائج تسلسل الفرقة تخطي من اثنين من المرضى قبل وبعد العلاج مع oligonucleotide مضاد للانداد في مرحلة تصعيد جرعة واحد. كلا المرضى يأوون الحذف كما هو متوقع، قبل العلاج، كلا المرضى أظهرت أي تخطي ويمكن تصور فقط الفرقة غير تخطي.
بعد 12 أسبوعا من العلاج، تم تصور شريط أقل تخطي واضح للمريض الثاني، ومع ذلك، كان لا يزال من الصعب الكشف عن أي منتج تخطي للمريض الأول. وأظهرت نتائج التسلسل سلسلة من exons 47 و 54 للمريض الثاني، والإيضانات، 44 و 54 للمريض الأول. لحساب النسبة المئوية المتخطية، تم تقسيم تركيز العث للشرائط التي تم تخطيها بواسطة الشرائط التي تم تخطيها وغير المُركّب.
كما هو متوقع، لم يتم الكشف عن أي عصابة ديستروفين بواسطة لطخة الغربية قبل العلاج. بعد العلاج ، تم الكشف عن شريط من المريض الثاني مع وزن جزيئي أقل مقارنة بتلك التي لوحظت في السيطرة الصحية. المريض الأول، ومع ذلك، لم تظهر مستويات يمكن الكشف عنها من الديستروفين بعد العلاج.
من المهم التعامل مع الأنسجة العضلية بشكل صحيح ، ووضع كل عينة على علكة تراجكانث بطريقة متسقة. يمكن تحليل أقسام الأنسجة بعدة طرق مختلفة، بما في ذلك صناعية ل PCR، PCR الرقمية، لطخة الغربية، الكيمياء المناعية، ومع أنواع مختلفة من omics. هذه التقنيات يمكن تسريع، وتطوير، exon إضافية تخطي المخدرات التي تستهدف إكسون مختلفة، ويمكن تطبيقها على تطوير الفيروسية القائمة ومرة أخرى في تحرير لDD.
