المكورات العنقودية هو بكتيريا إيجابية الجرام التي تنتج مجموعة واسعة من عوامل الفوعة التي تعزز التسبب في الأمراض. وتشمل هذه السميات ذات المكونات الثنائية التي تعطل سلامة الغشاء من الكريات البيض المتعددة الأشكال، وتسمى أيضا PMNs أو العدلات. يوضح هذا الفيديو عزلة الـ PMNs عن الدم الكامل البشري ومقايستين متميزتين لتحديد السمية الخلوية S.aureus ضد هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامة.
ويمكن إنجاز هذه المقايسات مع معدات المختبر القياسية ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة الجوانب الأخرى للتفاعل الممرض المضيف. وستستخدم هذه التجارب دماء كاملة من متبرعين بشريين، وسوف تتطلب موافقة اللجنة المؤسسية أو مجلس الاستعراض المناسبين، فضلا عن بيان بأن الموافقة المستنيرة قد تم الحصول عليها من جميع المشاركين. الخطوة الأولى من هذا الإجراء هي عزل العدلات من خلال استخدام التدرجات الطرد المركزي وكثافة.
أولاً، جلب 50 ملليلتر من 3٪دكستران 0.9٪كلوريد الصوديوم، 35 ملليلتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم، 20 ملليلتر من 1.8٪ كلوريد الصوديوم، 12 ملليلتر من 1.077 غراماً لكل ميل فيكول و20 ملليلتر من الماء إلى درجة حرارة الغرفة. نقل 25 ملليلتر من الدم البشري بأكمله المسحوب حديثا إلى أنبوبين مخروطيي الطرد المركزي المخروطية. الجمع بين 25 ملليلتر من الدم الكامل المُستخلص حديثاً مع 25 ملليلتراً ما يعادل حجم درجة حرارة الغرفة، 3٪ ديكستران، 0.9٪ كلوريد الصوديوم بنسبة واحد إلى واحد.
تخلط عن طريق هزاز بلطف كل أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ثم ترك الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة، سوف تظهر طبقتين منفصلتين. نقل الطبقة العليا من كل خليط الدم dextran في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر جديدة.
أجهزة الطرد المركزي عند 450 غ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع فواصل منخفضة أو معدومة. الطامح بعناية على حد سواء سراويل والتخلص من دون إزعاج الكريات الخلية. resuspend بلطف كل بيليه الخلية في مليلترين من 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
الجمع بين الكريات resuspended في واحد, 50 ملليلتر مخروطية ثم إضافة 0.9٪ كلوريد الصوديوم المتبقية إلى حجم النهائي من 35 ملليلتر. تحت بعناية 10 ملليلتر من 1.077 غراما في الميللي فيكول حل تحت تعليق الخلية باستخدام ماصة اليد. بعد الغزل في 450 غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة, مع انخفاض أو لا فواصل, pirate بلطف عظمى دون إزعاج بيليه الخلية, كما هو مبين سابقا.
lyse خلايا الدم الحمراء عن طريق resuspending بيليه الخلية في 20 ملليلتر من المياه درجة حرارة الغرفة. مزيج بلطف عن طريق هزاز لمدة 30 ثانية. على الفور إضافة 20 ملليلتر من 1.8٪ كلوريد الصوديوم وعينة الطرد المركزي في 450 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
pirnatate بعناية عظمى كما هو مبين من قبل. بلطف resuspend بيليه الخلية في اثنين من المليلتر درجة حرارة الغرفة RPMI ومكان على الجليد. عد الخلايا باستخدام مقياس الهد.
Resuspend تنقية PMNs بتركيز من مرة واحدة 10 إلى الخلايا 7 لكل ملليلتر مع الجليد البارد RPMI والحفاظ على الجليد. الجمع بين 100 ميكرولتردات من PMNs تنقية مع 300 ميكرولترات من DPBS، التي تحتوي على ميكرولتر واحد من وصمة عار يوديد بروبديسيوم في اثنين من أنابيب تدفق تكرار. للسيطرة الإيجابية، إضافة 40 ميكرولترات من 0.5٪ تريتون X-100 حل في واحدة من أنابيب تدفق القياسات البولية وخلطها جيدا.
استخدام تدفق cytometry لقياس مبعثر إلى الأمام، وتشتت الجانب، وروبودييوم يوديد تلطيخ لتحديد نقاء وسلامة PMNs معزولة. فقط PMN الاستعدادات التي هي فوق 98٪ نقية وفوق 95٪ propidium يوديد السالبة ينبغي أن تستخدم. للإشارة إلى البروتوكول الذي يحدد عزل مصل الإنسان العادي، راجع المخطوطة الكاملة.
إعداد لوحة 96-well لم مقايسات السمية الخلوية PMN عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من مصل الإنسان المعزول 20٪ المخفف مع DPBS إلى الآبار الفردية التي سيتم استخدامها في هذا الفحص. تأكد من تضمين عنصر تحكم سلبي واحد على الأقل جيدًا من شأنه أن يتلقى الوسائط فقط والتحكم الإيجابي واحد على الأقل جيدًا التي ستتلقى 0.05٪ Triton X.Incubate اللوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل الآبار المشفرة مرتين مع 100 ميكرولترات من الجليد الباردة DPBS وطبقة مكان على الجليد.
إزالة أي DPBS المتبقية من آبار لوحة وإضافة بلطف 100 ميكرولترات من PMNs الإنسان النقي في مرة واحدة 10 إلى الخلايا 7 في المليلتر إلى كل ترميز جيدا. السماح العدلات مطلي لتسوية عن طريق تركها على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل قبل استخدامها في المقايسات السامة للخلايا التالية. يصف هذا القسم فحصًا يحدد السمية الخلوية للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها المكورات العنقودية ضد الـ PMNs البشري.
ثقافة S.aureus بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام المناسبة باستخدام حاضنة اهتزاز تعيين في 37 درجة مئوية في اليوم السابق للتجربة. ثقافة فرعية S.aureus من خلال أداء واحد إلى 100 تخفيف ثقافات البكتيريا بين عشية وضحاها مع وسائل الإعلام الطازجة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز حتى البكتيريا تصل إلى مرحلة النمو الثابتة في وقت مبكر.
بعد خمس ساعات من النمو، نقل ملليلتر واحد من الزراعة الفرعية S.aureus إلى أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge والطرد المركزي في 5، 000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، طاردات التعرق. تمرير سبيجيرات من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge ومكان على الجليد.
أداء التخفيفات المسلسل من super مع وسائل الإعلام الباردة الجليد المستخدمة لثقافة Staph aureus. إضافة بلطف عينات فائقة أو وسائل الإعلام المعارة لضوابط سلبية وإيجابية إلى آبار فردية من لوحة 96 جيدا تحتوي على PMNs على الجليد، كما هو موضح في وقت سابق. لوحة صخرية بلطف لتوزيع اابار في آبار واحتضان في 37 درجة مئوية.
في الأوقات المرغوبة، وإزالة لوحة من الحاضنة ومكان على الجليد. إضافة 300 ميكرولتردات من الجليد الباردة DPBS تحتوي على ميكرولتر واحد من يوديد بروبدييوم إلى كل أنبوب تدفق cytometry. نقل العينات لتدفق أنابيب القياسات على الجليد.
للسيطرة الإيجابية جيدا، إضافة 20 ميكرولترات من 10٪ تريتون X إلى العينة قبل نقلها إلى أنبوب تدفق قياس الاستئصال. تحليل مادة يوديد البروديوم تلطيخ من PMNs في حالة سكر باستخدام تدفق cytometry. يصف هذا القسم مقايسة تحدد السمية الخلوية لـ S.aureus بعد البلعوم بواسطة الـ PMNs البشري.
يجب تحديد منحنيات النمو التي تحددها الكثافة البصرية في 600 نانومتر وتركيز البكتيريا لسلالات بكتيريا اُوروس ذات الصلة قبل استخدامها في هذا الفحص. بدء الثقافات بين عشية وضحاها من سلالات S.aureus والبكتيريا ثقافة فرعية، كما هو موضح سابقا. مرة واحدة في الاستزراع الفرعي Staph aureus وصلت إلى النمو في منتصف أسي, نقل ملليلتر واحد من البكتيريا الثقافة إلى 1.5 ملليلتر microcentuge أنبوب والطرد المركزي في 5, 000 ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
غسل S.aureus عن طريق التعرق لها دون إزعاج بيليه وإعادة تعليق البكتيريا بيليه في DPBS ملليلتر واحد. دوامة العينات لمدة 30 ثانية. الطرد المركزي العينات في 5،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
لتكنس ستاف aureus، أول resuspend بيليه البكتيريا في ملليلتر واحد من مصل الإنسان 20٪. ثم احتضان العينات في 37 درجة مئوية مع الانفعالات لمدة 15 دقيقة. غسل oxenized ستاف aureus بعد الطرد المركزي كما هو مبين سابقا.
تخفيف سلالات oxph aureus oxenized إلى مرة واحدة 10 إلى وحدات تشكيل مستعمرة 8، CFUs لكل ملليلتر، مع الجليد البارد RPMI. دوامة العينة لمدة 30 ثانية ومكان على الجليد. تأكيد تركيزات من بكتيريا aureus المستخدمة لهذه المقايسات عن طريق طلاء واحد إلى 10 تخفيف المسلسل من البكتيريا على أجار.
أضف بلطف 100 ميكرولترات لكل بئر من كل سلالة من سلالة Staph aureus ، أو RPMI للضوابط الإيجابية والسلبية ، إلى PMNs في لوحة 96-well على الجليد من الخطوة 1.14. لوحة صخرية بلطف لتوزيع Staph aureus في الآبار. مزامنة البلعميات بواسطة صفيحة الطرد المركزي في 500 غرام لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية وطبقة احتضان في 37 درجة مئوية مباشرة بعد الطرد المركزي كما صفر الوقت.
في النقاط الزمنية المطلوبة، ووضع لوحة على الجليد وإضافة 200 ميكرولترات من الجليد الباردة DPBS تحتوي على واحد microlit بروفيديوم يوديد لكل تدفق أنبوب cytometry ثم نقل العينات إلى أنبوب المقابلة. تحليل العينات لاليودينيوم ايودينيوم تلطيخ باستخدام تدفق القياسات cytometry كما هو موضح في 2.8 و 2.9. إن نسخ السميات السمية الثنائية المكون التي تستهدف الـ PMNs البشرية من قبل Staph aureus يتطلب من نظام مكون SA أو S2 إثبات فائدة عمليات الفحص الموصوفة لتحديد السمية الخلوية Staph aureus ضد النتّان البشري.
وقد أجريت هذه التجارب مع عزل Staph aureus ذات الصلة سريرياً التي تم تحديدها على أنها USA300 في محو حذف isologenic من SA أو S في هذه السلالة. وتصور اللوحة اليسرى الناينات نقّت الملوثات الـ PMN المنقّاة، وتُظهر اللوحة اليمنى العينات المُلوَّثة عمداً كمثال. تم لطخت PMNs المعزولة باستخدام الإجراءات الموصوفة في القسم الأول من هذا البروتوكول مع يوديد البروديوم وفحصها باستخدام عملية استئصال السيل.
تم استخدام مخططات التشتت الأمامية والجانبية للكشف عن تلوث النفضات PMNS المنقية بواسطة الخلايا الأحادية أو الخلايا الليمفاوية لسنوات 1A وتم تحديد سلامة PMN 1B. باستخدام تلطيخ يوديد البروديسيوم. باستخدام الطريقة الموصوفة لتنقية PMN الإنسان، يمكننا عزل باستمرار خمس مرات 10 إلى 7 إلى مرة واحدة 10 إلى 8 PMNs التي هي أكثر من 98٪ نقية وأكثر من 95٪ بروبديسيوم يوديد سلبي.
تم اختبار السمية الخلوية للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300 وAaeR / S متحولة ضد PMNs المنقاة. هذه التجارب تثبت زيادة التركيز تعتمد على تلطيخ الاودينيوم من الملوثات الثاهان ون نهايات تنقية بعد 30 دقيقة من التسمم مع البروتينات خارج الخلية التي تنتجها USA300، ولكن ليس مع اساير / S متحولة. وأظهرت تجارب أخرى زيادة مطردة في نسبة الـ(بروبيديميوم يوديد) الإيجابي PMNs بعد التسمم من قبل USA300 البروتينات خارج الخلية التي استقرت بعد حوالي 30 دقيقة.
لوحظ الحد الأدنى من يوديد البروديسيوم تلطيخ PMNs الإنسان في جميع النقاط الزمنية بعد التعرض للبروتينات خارج الخلية التي تنتجها AsaeR / S متحولة. وأخيرا، تم اختبار السمية الخلوية USA300 وAaeR / S متحولة ضد PMNs بعد البلعوم المتزامنة، لوحظ تركيز زيادة تعتمد في نسبة اليوديد الموجبة PMNs إيجابية 90 دقيقة بعد البلعمة USA300. وكان عدد أقل بكثير من PMNs يوديد البروديوم إيجابية بعد البلعمة من AsaeR / S متحولة.
وقد استخدم تعداد USA300 وAaeR / S متحولة inoculum في كل من هذه التجارب أظهرت أن التباين في السمية الخلوية بين هذه السلالات لم يكن بسبب الاختلافات في تركيز البكتيريا المستخدمة. يصف هذا البروتوكول تنقية PMNs من الدم البشري في تقنيتين متميزتين لتحديد السمية الخلوية لـ S.aureus ضد هذه الخلايا المناعية الفطرية. يعتمد نجاح هذه الإجراءات على جودة الـ PMNs المنقى والإعداد المناسب لبكتيريا أو بكتيريا البكتيريا أو المُنَابر الخارقة.
يرجى مراجعة المخطوطة الكاملة للاطلاع على النقاط الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار أثناء تنفيذ هذه الإجراءات. USA300 هو عزل MRSA خبيثة وفقدان AsaeR / S يقلل بشكل كبير من نسخ عوامل الفوعة التي تستهدف PMNs الإنسان، مما يجعل هذه السلالات نماذج مثالية لمقارنة السمية الخلوية باستخدام عمليات الفحص الموصوفة. قد تكون هناك حاجة إلى تكييف ظروف النمو، وأحجام المواد الفوقية المضافة، أو نسبة البكتيريا إلى الـ PMNs عند استخدام سلالات أخرى من سلالات ستاف أوريوس.
