وأيد هذا العمل من قبل معهد كينيدي شرايفر يونيس الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، NIH / DHHS. وأيد هذا العمل أيضا، في جزء منه، من خلال مبادرة جامعة واين ستيت في فترة ما حول الولادة صحة الأم وفترة ما حول الولادة وصحة الطفل. نحن نعترف بامتنان مورين McGerty (جامعة ولاية واين) لها قراءات نقدية للمخطوطة.

هذا البروتوكول هو المناسب لالكريات البيض بمعزل عن القاعدي الساقط والجدارية الساقط استعدادا لالمناعي التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا المعزولة يمكن استخدامها لفرز الخلايا، زراعة الخلايا، والعزلة RNA، وعلم الخلايا. قبل العمل مع العينات المشار إليها في هذا البروتوكول، يجب الحصول على الموافقة الأخلاقية الإنسان من لجنة أخلاقيات البحوث المحلية ومجالس المراجعة المؤسسية. تمت الموافقة على جمع واستخدام العينات البشرية لأغراض البحث من قبل مجالس المراجعة المؤسسية للمعهد الوطني يونيس كينيدي شرايفر لصحة الطفل والتنمية البشرية (معاهد الصحة القومية) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، وزارة الصحة والخدمات البشرية (DHHS في بيثيسدا، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) وجامعة ولاية واين (MI ديترويت، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على موافقة خطية من علم جميع النساء الحوامل قبل مجموعة من عينات الأنسجة. ملاحظة: بينما كان يعمل مع دم الحيوانات، والخلايا، أو مخاطروكلاء الأوس كما هو مذكور في هذا البروتوكول، فمن الضروري أن السلامة الأحيائية المناسبة والإجراءات الواجب اتباعها سلامة المختبرات. 1. تشريح لساقطي الأنسجة البشرية ملاحظة: لوحة القاعدية هي قاعدة تحت وتعلق على المشيمة وتمثل سطح الأمهات. وتشمل الأغشية chorioamniotic السلى والمشيمه. تتضمن لوحة القاعدية والقاعدي الساقط ويتضمن المشيمه في الجدارية الساقط (الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الساقط القاعدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح قطعة من لوحة القاعدية من فلقة واحدة من المشيمة (أرقام 1A و 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعه على لوح التقطيع العقيمة مع الزغابات المشيمية التي تواجه التصاعدي. الجانب تظهر الزغابات المشيمية عادة الدموية الحمراء مع النسيج شعر في المظهر. لوحة القاعدية على نحو سلس وشاحب اللون الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حادة، ومقص غرامة نقطة وملقط لإزالة VILLالأنسجة والأوعية الدموية الأوس. الحفاظ على الأنسجة غارقة في برنامج تلفزيوني 1X (كا 2+ - والمغنيسيوم 2+ - مجانا) أثناء عملية (الشكل 1C). جمع 2-3 من هذه القطع وشطف لهم بدقة مع 1X PBS لإزالة الدم (1D الشكل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الساقط الجداري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح قطعة من الأغشية chorioamniotic (حوالي 10 سم x 10 سم، الشكل 1E). وضعه على متن الطائرة مع المشيمه تواجه التصاعدي. ويتضمن الجانب المشيمي الجلطات الدموية وعادة ما يكون ضوء مصفر اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة نقطة لإزالة أكبر عدد ممكن من جلطات الدم ممكن (الشكل 1E). شطف الغشاء في العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لتنظيف الدم الزائد من الغشاء حتى يدير برنامج تلفزيوني 1X واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مكشطة الخلية معقمة المتاح لكشط بلطف طبقة الساقطية من الغشاء. تطبيق العقيمة 1X PBS على ذاكرةالغشاء حين الانتهاء من هذه العملية (الشكل 1F). جمع الأنسجة الساقطية ووضعها في أنبوب بلاستيكي 50 مل العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (الشكل 1G). </li></ol></li></ol> 2. الميكانيكية تصنيفها والأنزيمية الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل تشريح الأنسجة من القاعدي الساقط (من الخطوة 1.1.3) أو الجدارية الساقط (من الخطوة 1.2.3) مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب بلاستيكي 50 مل. جمع الكريات الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف تقع فوق بيليه الأنسجة بعناية من دون إزعاج بيليه. ملاحظة: عند هذه النقطة، الكريات هي فضفاضة جدا لأنها تحتوي على خلايا الدم الحمراء. إذا كان حجم الكرية حوالي أو أقل من 3 مل، وإعادة تعليق بيليه في 6 مل من محلول مفرزة الخلية قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. إذا كان بيليه هو أكبر من 3 مل من حجم، إضافة المزيد من حل مفرزة الخلية (إضافة حوالي 2 مرات عشرحجم (ه) من عينات الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة المتجانس (القاعدي الساقط + انفصال الخلايا حل أو الساقط الجداري + حل مفرزة الخلية) إلى أنبوب C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب C في dissociator التلقائي وتشغيل البرنامج المقابل. ملاحظة: البرنامج لالقاعدي الساقط يعمل لمدة 17 ثانية مع 668 مجموع طلقة في التشغيل. برنامج للالجدارية الساقط يعمل لمدة 37 ثانية مع 235 مجموع طلقة في التشغيل. وقد تم تخصيص هذه البرامج لعزل الكريات البيض من القاعدي الساقط أو الجدارية الساقط مع العائد الجيد وبقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تصنيف الميكانيكية للأنسجة، هضم الأنسجة مع متوفرة تجاريا حل مفرزة الخلية مثل accutase. (كوكتيل يحتوي على بروتين وأنزيمات حال الكولاجين) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. </li></ol> 3. عزل الكريات البيضاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى digestion خليط وتمريرها من خلال خلية مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب بلاستيكي. اعتمادا على التصاق الخليط الهضم، واحدة قد تحتاج إلى استخدام عدة مصافى خلية للخليط واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة برنامج تلفزيوني 1X فوق الكريات خلية بعناية واعادة تعليق الكريات مع 5 مل من الجليد الباردة FACS العازلة. ملاحظة: لدراسة النوى وحيدات النوى الكريات البيض معا، انتقل إلى الخطوة 6.1. لدراسة الكريات البيض وحيدات النوى، انتقل إلى الخطوة 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من 20٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) إلى 15 مل أنبوب بلاستيكي وتراكب ببطء تعليق الخلية على رأس وسائل الإعلام التدرج الكثافة. في حين طبقات العينة، فمن المهم عدم خلط وسائل الإعلام التدرج الكثافة مع تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي مع الدوار سوينغ بها في 500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 مئوية دون فرامل. من المهم جدا لإيقاف الفرامل لتجنب الخلط الخلايا ولosing التدرج. ويمكن الاطلاع على الكريات البيض في واجهة بين وسائل الإعلام كثافة التدرج وعازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على FACS العازلة والخلايا الحطام بعناية فائقة باستخدام ماصة. الفرقة في واجهة تحتوي الخلايا وحيدة النواة الساقطية وجزء من الكريات البيض النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في واجهة تماما إلى 15 مل جديد أنبوب من البلاستيك. إضافة على الأقل 3 مرات أكثر حجم العازلة FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لبلتيز الخلايا. نضح طاف وغسل الخلايا مع العازلة FACS. بلتيز الخلايا مع الطرد المركزي أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. ملاحظة: لإجراء زراعة الخلايا، انظر الخطوة 4. لإجراء فرز الخلايا، انظر الخطوة 5. لأداء المناعي، انظر الخطوة 6. </li></ol> 4. تطبيقات - خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من RPMI مستنبت 1640. عد خلايا قابلة للحياة باليودنانوغرام عداد الخلايا التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيف ما يصل مقدار RPMI مستنبت لجعل تركيز خلية من 1 × 10 6 خلية / مل. الخلايا هي الآن جاهزة للثقافة. </li></ol> 5. تطبيقات - عزل الضامة للثقافة الخلية الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل CD14 + الخلايا مغناطيسيا تسمية الخلايا من الخطوة 3.7 مع بلي CD14 (20 حبات ميكرولتر في 10 7 الخلايا)، واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 ج، وCD14 منفصل + خلايا من أنواع أخرى من الخلايا من خلال تطبيق مجال مغناطيسي. بعد 2 يغسل مع MACS العازلة وإزالة الحقل المغناطيسي للأرض، أزل CD14 + الخلايا الاحتفاظ مغناطيسيا مع العازلة MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات خلية في RPMI مستنبت 1640. الخلايا جاهزة للطلاء (الشكل 2). </li></ol> 6. تطبيقات - المناعي الظاهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا للimmunophenotyping، اعادة تعليق الخلايا من الخطوة 3.7 في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عداد الخلية التلقائي أو عدادة الكريات وحل التريبان الأزرق 0.4٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية الخلايا مع صبغة الجدوى قابل للتثبيت (الشكل 3). غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS واعادة تعليق الخلايا في المخزن وصمة عار. احتضان مع مانع FCR لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الخلية مترافق إلى fluorochromes. على سبيل المثال، في هذا البروتوكول، استخدم مكافحة CD3، ومكافحة CD19، ومكافحة CD14، ومكافحة CD15، ومكافحة CD56 الأجسام المضادة (الجدول 1). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، وسيتم تحليل الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة وصمة عار باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويرد تمثيل استراتيجية النابضة المستخدمة لتحليل الفرعية من السكان الكريات البيض الموجودة في الأنسجة الساقطية في الشكل (4). </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

توصيف الخصائص الفنية والمظهرية لالتسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري ضروري لفهم الآليات المناعية التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة تقنيات من أجل عزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري طوال فترة الحمل 10،14،25،28،37،42،43. ومع ذلك، كل هذ...

يتميز الحمل عن طريق ثلاث مراحل متميزة المناعية: 1) غرس والمشيمة المبكرة المرتبطة استجابة الموالية للالتهابات (أي زرع يشبه &quot;جرح مفتوح &#39;)؛ 2) الثلث الثاني من الحمل وأكثر من الثلث الثالث من الحمل عندما يتم تحقيق توازن المناعة من خلال دولة في الغالب مضادة للالتهابات في واجهة الأم والجنين. و3) الولادة، دولة الموالية للالتهابات 1-7. الخلايا المناعية تلعب دورا هاما في تنظيم الاستجابة الالتهابية في واجهة الأم والجنين حيث وفرة والتغيير توطين طوال فترة الحمل 6-9. في البشر، واجهة الأم والجنين تمثل مساحة الاتصال المباشر بين الأم (الساقط) والجنين (المشيمه أو الأرومة الغاذية) الأنسجة. هذه الواجهة تشمل ما يلي: 1) الجدارية والساقط الذي يبطن تجويف الرحم لم تتم تغطيتها عن طريق المشيمة وهي في تجاورلأجرد المشيمه. و2) القاعدي الساقط، وتقع في لوحة القاعدية من المشيمة حيث غزت من قبل trophoblasts فراغي 10 (الشكل 1). العلاقة الحميمة من هذه المناطق للاتصال تخلق الظروف لتعرض الجنين الأنتيجين إلى الأمهات الجهاز المناعي 11-13. ليس من المستغرب أن الكريات البيض يشكلون ما يقرب من 30-40٪ من الخلايا الساقطية 8،9،14،15 بالإضافة إلى خلايا انسجة من نوع نموذجية والخلايا الغدية 8،14،16. دور الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يشمل العمليات المتعددة التي تشمل الحد من الأرومة الغاذية الغزو 17، وتدبير الشرايين دوامة 18،19، والحفاظ على التسامح الأمهات 12،20، والشروع في العمل 21-26. الكريات البيض من كل من التكيف وأطرافه الفطرية في الجهاز المناعي، أي خلايا T، الضامة، وقد تم تحديد العدلات، والخلايا B والخلايا الجذعية، والخلايا القاتلة الطبيعية، في الأنسجة الساقطية، وعلىوقد ثبت النسب وحالة التنشيط تختلف مكانيا وزمانيا طوال فترة الحمل 6-10،12،14،24،27-30. وترتبط اضطرابات في عدد الكريات البيض و / أو وظيفة مع الإجهاض العفوي 31، تسمم الحمل 32، وزن الولادة 32،33، والخدج العمل 7،24. ولذلك، فإن دراسة الصفات المظهرية وظيفة الكريات البيض في واجهة الأم والجنين البشري تسهيل توضيح من مسارات المناعية dysregulated في اضطرابات الحمل. واحدة من أقوى الأدوات المستخدمة لتحديد النمط الظاهري وخصائص وظيفية من الكريات البيض والتدفق الخلوي والتكنولوجيا التي تسمح للتحليل الكمي للمعلمات متعددة في وقت واحد 34-36. لتحليل الكريات البيضاء التي التدفق الخلوي، مطلوب عزل الكريات البيض في تعليق وحيد الخلية. لذلك، وهي طريقة لفصل التسلل ليووهناك حاجة kocytes من واجهة الأم والجنين لدراسة المظهرية وخصائصها الوظيفية. وقد وصفت عدة طرق لعزل الكريات البيض من واجهة الأم والجنين البشري 10،14،25،27،37-39. في حين أن بعض تطبيق تصنيف الميكانيكية 10،25،27،38، والبعض الآخر يستخدم الهضم الأنزيمي 37،40 لتفكك الأنسجة. لأن تفصيل الميكانيكية تنتج العائد أقل وانخفاض الجدوى 41، وتفارق الأنزيمية يمكن أن تؤثر على سلامة وسطح الخلية الاحتفاظ علامة 42، الأسلوب هو موضح هنا يجمع بين التفكك الميكانيكية لطيف مع الأنزيمية ما قبل المعالجة لزيادة الغلة من الكريات البيض معزولة دون المساس بقاء الخلية. وقد تجلى مزيج مماثل من الطرق لتكون فعالة في عزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية في واجهة الأم والجنين 39. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا ينطوي ميكاتصنيف nical مع dissociator الأنسجة التلقائي الذي يزيد من الاتساق مع توفير الوقت والعمل بالمقارنة مع تنميق التقليدي مع معارضة المشارط، شفرات الحلاقة، أو مقص جراحي 10،28. كان الإنزيم الذي تم اختياره لتفكك النسيج Accutase. على عكس كولاجيناز تستخدم عادة 43، dispase 44، والتربسين 45، Accutase (حل مفرزة الخلية) يجمع بين بروتين العام وأنشطة حال الكولاجين التي تسهم في كفاءة تفارق بعد لطيف 46،47. بعد التفكك، وإثراء الكريات البيض من مجموع السكان من الخلايا الساقطية التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي. وقد وسائل الإعلام المختلفة الكثافة التدرج تستخدم في السابق، والأكثر شيوعا منها Percoll (تعليق جسيمات السيليكا الغروية) 48 و Ficoll (البوليمر من السكروز مع ارتفاع الوزن الجزيئي الاصطناعية) 49. وكانت كفاءة متفوقة من العزلة التي فرضها البوليمر السكروز previoأظهرت usly 50، والبروتوكول وصفها أيضا هنا يثبت أن هذه الوسائط التدرج الكثافة تنتج نقاء عالية بما فيه الكفاية من الكريات البيض وحيدات النوى. وبالتالي، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين تصنيف الأنسجة الميكانيكية مع dissociator التلقائي الأنسجة، والهضم الأنزيمي مع حل مفرزة الخلية، وفصل الكريات البيض مع وسائل الإعلام التدرج الكثافة (1.077 + 0.001 غ / مل) لعزل الكريات البيض من أنسجة الساقطية الإنسان. وقد ثبت هذا البروتوكول للحفاظ على مستضدات سطح الخلية مع بقاء الخلية. الكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات متعددة تشمل المناعي مع التدفق الخلوي والدراسات الفنية في المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

يتميز الحمل عن طريق تسلل الكريات البيض في الأنسجة التناسلية وعلى واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري). هذه الواجهة هو الموقع التشريحي للاتصال بين الأم وأنسجة الجنين. وبالتالي، فإنه هو موقع المناعية للعمل خلال فترة الحمل. التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين دورا أساسيا في غرس والصيانة الحمل، وتوقيت التسليم. ولذلك، فإن الأوصاف المظهرية والوظيفية لهذه الكريات البيض توفر نظرة ثاقبة الآليات التي تؤدي إلى اضطرابات الحمل. وقد وصفت عدة بروتوكولات من أجل عزل التسلل الكريات البيض من القاعدي الساقط والجدارية الساقط. ومع ذلك، فإن عدم الاتساق في الكواشف، والإنزيمات، ومرات من الحضانة يجعل من الصعب مقارنة هذه النتائج. الموصوفة هنا هو نهج الرواية التي تجمع بين استخدام ديس الميكانيكية والأنزيمية لطيفتقنيات ociation للحفاظ على سلامة ونزاهة علامات خارج الخلية والخلايا في الكريات البيض معزولة عن الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين. وبصرف النظر عن المناعي، زراعة الخلايا، والفرز الخلية، والتطبيقات المستقبلية من هذا البروتوكول عديدة ومتنوعة. بعد هذا البروتوكول، والكريات البيض معزولة يمكن استخدامها لتحديد الحامض النووي والتعبير عن الجينات المستهدفة، في وظائف المختبر الكريات البيض (أي البلعمة، سمية الخلايا وانتشار الخلايا التائية، واللدونة، وما إلى ذلك)، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية في واجهة الأم والجنين. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام بروتوكول وصفها، لقد كان هذا المختبر قادرة على وصف الكريات البيض جديدة ونادرة في واجهة الأم والجنين.

. يظهر تشريح الأنسجة البشرية في واجهة الأم والجنين (القاعدي الساقط والساقط الجداري) في الشكل رقم 1 ويشمل هذا الإجراء تشريح لوحة القاعدية، والذي يتضمن القاعدي الساقط (الشكل 1A - D). يتم الحصول على القاعدي الساقط عن طريق إزالة الزغب المشيمي (الج?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K Views.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان الأنثى التناسلي للدراسات الشكلية والوظيفية

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...