مستقبلات المناعة NLR تلعب دورا حاسما في التوسط الدفاع النباتي ضد مسببات الأمراض المختلفة. نحن وصف القرب TurboID القائمة على طريقة وضع العلامات لتحديد التفاعل الشركاء من عدد / interleukin - 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على NLRs مثل مستقبلات المناعة في النباتات بنثامايان Nicotiana. يوفر هذا البروتوكول مرجعا هاما للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتيني في الأنواع النباتية الأخرى ويمكن أن تمتد إلى أي بروتين الفائدة في Nicotiana benthamiana.
إن نهج وضع العلامات على القرب من TurboID له ميزة مميزة على النهج التقليدية لأنه يمكن استخدامه لالتقاط تفاعلات البروتين البروتينية العابرة أو الضعيفة في الجسم الحي. تبدأ من خلال زراعة بذور N.benthamiana في التربة الرطبة في كثافة عالية. الحفاظ عليها في غرفة المناخ مع ضوء 18 ساعة و8 ساعات فترة الصورة المظلمة في 23 إلى 25 درجة مئوية.
إبقاء النباتات في الغرفة لمدة أربعة أسابيع تقريبا حتى أنها تنمو إلى مرحلة ورقة من أربعة إلى ثمانية للتصفية الزراعية اللاحقة. بناء الانصهار TurboID وتحويل البلازميدات إلى الخلايا المختصة Agrobacterium tumefaciens كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدام حقنة واحدة ملليلتر بدون إبرة للتسلل inoculum من البشرة abaxial من أوراق N.benthamiana ناضجة تماما.
في 36 ساعة بعد الترشيح، التسلل 200 البيوتين ميكرومولار في الأوراق والحفاظ على النبات لمدة ثلاث إلى 12 ساعة إضافية قبل حصاد أنسجة ورقة. لجمع عينة ورقة، وقطع الأوراق المتسللة في قاعدة petiole، وإزالة الوريد ورقة، وفلاش تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. طحن الأنسجة ورقة مع الحشرات وقذائف الهاون وتخزين مسحوق في أنابيب فالكون 15 أو 50 ملليلتر في ناقص 80 درجة مئوية.
لاستخراج البروتين الكلي، نقل حوالي 0.35 غرام من مسحوق ورقة إلى أنبوب ملليلتر اثنين. تأكد من الحفاظ على الأنسجة في درجة حرارة منخفضة في النيتروجين السائل خلال هذه العملية. إضافة 700 ميكرولترات من العازلة ريبا تحلل إلى مسحوق.
دوامة الأنبوب لمدة 10 دقائق وترك العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة، وخلط المحتويات كل أربع إلى خمس دقائق عن طريق عكس الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 20،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم جمع ناظر.
إزالة البيوتين الحرة عن طريق تشغيل العينة من خلال عمود desalting. إزالة السدادة في الجزء السفلي من العمود ووضعها في أنبوب 50 ملليلتر. ثم تخفيف الغطاء والطرد المركزي العمود في 1، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين.
ضع عمود desalting في أنبوب 50 ملليلتر جديدة وتكف العمود ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من العازلة ريبا تحلل. جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين والتخلص من تدفق من خلال كل مرة. إضافة 1.5 ملليلتر من مستخلص البروتين إلى أعلى الراتنج في العمود توازنها.
وعندما يدخل استخراج الراتنج، إضافة 100 ميكرولترات أخرى من العازلة تحلل RIPA. الطرد المركزي العمود لمدة دقيقتين وترك العينات desalted على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. لتحديد كمي مستخلصات البروتين المُستخلصة من المياه، قم بقياس OD595 باستخدام مقياس طيفي Bio-Rad.
رسم منحنى قياسي على أساس قيمة حل BSA التدرج وحساب تركيز عينات البروتين desalteded. اكويبيرت streptavidin C1 الخرز المغناطيسي مترافق مع ملليلتر واحد من العازلة ريبا تحلل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدام رف المغناطيسي لامتصاص الخرز لمدة ثلاث دقائق وتبخر بلطف الحل.
ثم كرر غسل مرة أخرى. نقل استخراج البروتين إلى الخرز المغناطيسي توازنها واحتضان الأنبوب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على دوار لتقارب تنقية البروتينات. في اليوم التالي، التقاط الخرز مع رف المغناطيسي وpirate اضحا.
المقبل، وغسل الخرز مع 1.7 ملليلتر من غسل العازلة واحدة عن طريق إضافته إلى أنبوب واحتضان على الدوار لمدة ثماني دقائق. إزالة supernatant كما هو موضح سابقا وكرر غسل مع 1.7 ملليلتر من العازلة غسل اثنين وغسل العازلة ثلاثة. إضافة 1.7 ملليلتر من 50 ملليمولار تريس HCL لإزالة المنظفات.
ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وأزل المابير. كرر الغسيل مع ملليلتر واحد من 50 ملليمولار تريس HCL ونقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. وأخيرا، يغسل الخرز ست مرات مع 50 ميليمولار بيكربونات العازلة لمدة خمس دقائق لكل غسل.
استخدام 100 ميكرولترات من الخرز لتحليل مناعية لتأكيد إثراء البروتينات الحيوية وتجميد فلاش بقية العينة ليتم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. استخدمت البقع الغربية لتحليل التعبير البروتيني و biotinylation في أوراق N.benthamiana الزراعية. تم إثراء البروتينات الحيوية في الأوراق المتسللة بكفاءة مع الخرز المغناطيسي Streptavidin C1 المقترنة لتحليل الطيف الشامل اللاحقة.
تم التقاط بروتينات مختلفة بأحجام متنوعة وأظهر تحليل البقعة الغربية للبروتينات المخصبة نطاقات ملطخة. عند محاولة هذا الإجراء، يرجى تذكر لإزالة السدادة في الجزء السفلي من العمود desalting وتخفيف القبعات قبل كل الطرد المركزي. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة مع غيرها من البروتينات ذات الأهمية في Nicotiana benthamiana ويمكن أيضا أن تستخدم لتوسيع PL TurboID في الأنواع النباتية الأخرى.
