NLR immün reseptörleri çeşitli patojenlere karşı bitki savunma aracılık önemli bir rol oynamaktadır. Nicotiana benthamiana tesislerinde ki immün reseptörler gibi NLR'leri içeren Toll/interlökin-1 reseptör etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için TurboID tabanlı yakınlık etiketleme yöntemini tanımladık. Bu protokol diğer bitki türlerinde protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemli bir referans sağlar ve Nicotiana benthamiana ilgi herhangi bir protein genişletilebilir.
TurboID tabanlı yakınlık etiketleme yaklaşımı geleneksel yaklaşımlara göre belirgin bir avantaja sahiptir, çünkü geçici veya zayıf protein-protein etkileşimlerini vivo olarak yakalamak için kullanılabilir. Yüksek yoğunlukta ıslak toprakta N.benthamiana tohumları yetiştirerek başlayın. 23 ila 25 santigrat derece 18 saat ışık ve sekiz saatlik karanlık fotoğraf süresi ile bir iklim odasında bakım.
Onlar sonraki agroinfiltrasyon için dört ila sekiz bir yaprak aşamasına kadar yaklaşık dört hafta boyunca odada bitkiler tutun. TurboID füzyonları inşa edin ve plazmidleri metin protokolünde açıklandığı gibi yetkili hücreleri Agrobacterium tumefaciens'e dönüştürün. Tamamen olgun N.benthamiana yapraklarının abaxial epidermisinin inoculum inoculum sızmak için bir mililitre iğnesiz şırınga kullanın.
36 saat post-filtrasyon, yaprakiçine 200 mikromolar biotin sızmak ve yaprak dokusu hasat önce ek bir 3 ila 12 saat için bitki korumak. Yaprak örneği toplamak için, petiole tabanında sızmış yaprakları kesmek, yaprak damarı kaldırmak ve flaş sıvı azot doku dondurmak. Bir havaneli ve harç ile yaprak dokusu grind ve eksi 80 santigrat derece 15 veya 50 mililitre Likkar tüpleri toz saklayın.
Toplam proteini çıkarmak için, yaklaşık 0,35 gram yaprak tozunun iki mililitrelik bir tüpe aktarılması. Bu işlem sırasında sıvı nitrojen düşük sıcaklıkta doku korumak için emin olun. Toz için RIPA lysis tampon 700 mikrolitre ekleyin.
Tüpü 10 dakika boyunca girdaplayın ve numuneyi 30 dakika buzda bırakın, tüpleri ters çevirerek her 4-5 dakikada bir içindekileri karıştırın. Tüpleri 20,000 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Sonra supernatant toplamak.
Numuneyi tuzsuzlama sütununa geçirerek serbest biotin'i çıkarın. Köşenin altındaki ucumu çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Sonra kapağı gevşetin ve iki dakika boyunca 1, 000 kez g ve dört derece santigrat sütun santrifüj.
Tuzsuzlama sütununa taze bir 50 mililitrelik tüp yerleştirin ve beş mililitre RIPA lysis tamponu yla sütunu üç kez dengeleyin. 1,000 kez g ve dört santigrat derece iki dakika için santrifüj ve akış her zaman atmak. Dengedeki sütundaki reçinenin üstüne 1,5 mililitre protein ekstresi ekleyin.
Ve ekstresi reşin girdiğinde, RIPA lysis tampon başka 100 mikrolitre ekleyin. Koloniki dakika santrifüj ve daha fazla kullanıma kadar buz üzerinde tuzsuz örnekleri bırakın. Tuzsuz protein özlerini ölçmek için Bio-Rad spektrofotometre kullanarak OD595'i ölçün.
Degrade BSA çözeltisinin değerine göre standart eğriyi çizin ve tuzsuz protein örneklerinin konsantrasyonunu hesaplayın. Streptavidin C1 konjuge manyetik boncukları oda sıcaklığında bir dakika boyunca bir mililitre RIPA lysis tamponu ile dengeleyin. Üç dakika boyunca boncuk emmek ve yavaşça çözelti aspire için manyetik raf kullanın.
Sonra yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Protein ekstresini dengedeki manyetik boncuklara aktarın ve proteinleri arındırmak için bir rotator üzerinde bir gecede tüpü dört derece yetüp tüpe inküler. Ertesi gün, bir manyetik raf ile boncuk yakalamak ve supernatant aspire.
Daha sonra, tüpe ekleyerek 1,7 mililitre yıkama tamponu ile boncukları yıkayın ve sekiz dakika boyunca rotor üzerinde kuluçkaya yatırın. Supernatant daha önce açıklandığı gibi çıkarın ve yıkama tampon iki 1.7 mililitre ve yıkama tampon üç ile yıkama tekrarlayın. Deterjanı çıkarmak için 1,7 mililitre 50 milimolar Tris HCL ekleyin.
Sonra manyetik raf üzerine tüp yerleştirin ve supernatant çıkarın. 50 milimolar Tris HCL bir mililitre ile yıkama tekrarlayın ve yeni bir 1.5 mililitretüp boncuk transfer. Son olarak, yıkama başına beş dakika 50 milimolar amonyum bikarbonat tampon ile boncuk altı kez yıkayın.
Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesini onaylamak için immünoblot analizi için boncuk 100 mikrolitre kullanın ve flaş eksi 80 santigrat derecede depolanacak numunenin geri kalanını dondurmak. Batı lekeleri tarıma sızmış N.benthamiana yapraklarında protein ekspresyonu ve biyotinylation analiz etmek için kullanılmıştır. Sızmış yapraklarda biyotinylated proteinler verimli streptavidin C1 sonraki kütle spektrometresi analizi için konjuge manyetik boncukile zenginleştirilmiştir.
Çeşitli boyutlarda farklı proteinler ele geçirildi ve zenginleştirilmiş proteinlerin Batı leke analizinde bulaşmış bantlar saptandı. Bu yordamı denerken, lütfen tuzluk sütununun altındaki mastarı çıkarmayı ve her santrifüjden önce kapakları gevşetmeyi unutmayın. Bu protokol, Nicotiana benthamiana'daki diğer proteinlere kolayca uyarlanabilir ve diğer bitki türlerinde TurboID PL'yi genişletmek için de kullanılabilir.
