NLR-Immunrezeptoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Pflanzenabwehr gegen verschiedene Krankheitserreger. Wir beschreiben eine TurboID-basierte Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern von Toll/Interleukin-1-Rezeptoren, die NLRs wie Immunrezeptoren in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen enthalten. Dieses Protokoll bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in anderen Pflanzenarten und kann auf jedes Protein von Interesse in Nicotiana benthamiana erweitert werden.
Der TurboID-basierte Näherungsetikettierungsansatz hat einen deutlichen Vorteil gegenüber den herkömmlichen Ansätzen, da er verwendet werden kann, um transiente oder schwache Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu erfassen. Beginnen Sie mit dem Anbau von N.benthamiana Samen in nassen Böden mit einer hohen Dichte. Bewahren Sie sie in einer Klimakammer mit einem 18-stündigen Hellen und einer achtstündigen dunklen Fotoperiode bei 23 bis 25 Grad Celsius auf.
Halten Sie die Pflanzen in der Kammer für etwa vier Wochen, bis sie bis zu einem Blattstadium von vier bis acht für die nachfolgende Agroinfiltration wachsen. Konstruieren Sie TurboID-Fusionen und wandeln Sie die Plasmide in Agrobacterium tumefaciens kompetente Zellen um, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie eine ein Milliliter nadellose Spritze, um das Inokulum der abaxialen Epidermis der vollreifen N.benthamiana Blätter zu infiltrieren.
Nach 36 Stunden nach der Filtration 200 mikromolares Biotin in die Blätter infiltrieren und die Pflanze für weitere drei bis zwölf Stunden pflegen, bevor das Blattgewebe geerntet wird. Um die Blattprobe zu sammeln, schneiden Sie die infiltrierten Blätter an der Basis der Petiole, entfernen Sie die Blattvene und blitzen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Das Blattgewebe mit einem Stößel und Mörtel mahlen und das Pulver in 15 oder 50 Milliliter Falcon-Röhren bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Um das Gesamteprotein zu extrahieren, übertragen Sie etwa 0,35 Gramm Blattpulver in eine Zwei-Milliliter-Röhre. Achten Sie darauf, das Gewebe bei niedriger Temperatur im flüssigen Stickstoff während dieses Prozesses zu halten. 700 Mikroliter RIPA-Lysepuffer in das Pulver geben.
Wirbeln Sie die Röhre für 10 Minuten und lassen Sie die Probe auf Eis für 30 Minuten, mischen Sie den Inhalt alle vier bis fünf Minuten durch Invertieren der Rohre. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann sammeln Sie den Überstand.
Entfernen Sie das freie Biotin, indem Sie die Probe durch eine Entsalzungssäule führen. Entfernen Sie die Versiegelung am unteren Rand der Säule und legen Sie sie in ein 50-Milliliter-Rohr. Dann lösen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie die Säule bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten.
Legen Sie die Entsalzungssäule in eine frische 50-Milliliter-Röhre und gleichnden Sie die Säule dreimal mit fünf Millilitern RIPA-Lysepuffer. Zentrifugieren Sie es bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten und entsorgen Sie den Durchfluss jedes Mal. Fügen Sie 1,5 Milliliter Proteinextrakt an die Oberseite des Harzes in der ausgeglichenen Spalte hinzu.
Und wenn der Extrakt in das Harz gelangt, fügen Sie weitere 100 Mikroliter RIPA-Lysepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten und lassen Sie die entsalzten Proben bis zur weiteren Verwendung auf Eis. Um die entsalzten Proteinextrakte zu quantifizieren, messen Sie den OD595 mit einem Bio-Rad Spektralphotometer.
Zeichnen Sie die Standardkurve basierend auf dem Wert der Gradienten-BSA-Lösung und berechnen Sie die Konzentration der entsalzten Proteinproben. Equilibrate die Streptavidin C1 konjugierten magnetischen Perlen mit einem Milliliter RIPA Lyse Puffer für eine Minute bei Raumtemperatur. Verwenden Sie das magnetische Rack, um die Perlen für drei Minuten zu absorbieren und die Lösung sanft zu aspirieren.
Wiederholen Sie dann die Wäsche noch einmal. Übertragen Sie den Proteinextrakt auf die gleichgewichtig geschalteten Magnetperlen und bebrüten Sie die Röhre bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Rotator, um die Proteine zu reinigen. Am nächsten Tag fangen Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack und aspirieren Sie den Überstand.
Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 1,7 Milliliter Waschpuffer eins, indem Sie es in das Rohr hinzufügen und inkubieren Sie es auf dem Rotor für acht Minuten. Entfernen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie die Wäsche mit 1,7 Milliliter Waschpuffer zwei und Waschpuffer drei. Fügen Sie 1,7 Milliliter 50 Millimolar Tris HCL hinzu, um das Reinigungsmittel zu entfernen.
Legen Sie dann das Rohr auf das magnetische Rack und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche mit einem Milliliter 50 Millimolar Tris HCL und übertragen Sie die Perlen auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. Schließlich waschen Sie die Perlen sechsmal mit 50 Millimolar Ammonium Bicarbonat Puffer für fünf Minuten pro Wäsche.
Verwenden Sie 100 Mikroliter Perlen für die Immunoblot-Analyse, um die Anreicherung der biotinylierten Proteine zu bestätigen und den Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren. Westliche Flecken wurden verwendet, um die Proteinexpression und Biotinylierung in den agrofiltrierten N.benthamiana Blättern zu analysieren. Die biotinylierten Proteine in den infiltrierten Blättern wurden effizient mit Streptavidin C1 konjugierten Magnetperlen für die anschließende Massenspektrometrieanalyse angereichert.
Verschiedene Proteine mit unterschiedlichen Größen wurden eingefangen und die Western-Blot-Analyse der angereicherten Proteine zeigte verschmierte Bänder. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie bitte daran, die Versiegelung an der Unterseite der Entsalzungssäule zu entfernen und die Kappen vor jeder Zentrifugation zu lösen. Dieses Protokoll ist leicht an andere Proteine von Interesse in Nicotiana benthamiana anpassbar und kann auch verwendet werden, um die TurboID PL in anderen Pflanzenarten zu erweitern.
