Chromatin المناعية تليها التسلسل ، أو ChIP -eq ، هو الأسلوب الذي يمكن استخدامه لاكتشاف الأهداف التنظيمية لعوامل النسخ ، وتعديلات الحجر الهحي ، وغيرها من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي. في ChIP-seq، يتم حصاد الخلايا والبروتين الحمض النووي الملزم. يتم عبر المرتبطة بالحمض النووي في الجسم الحي مع الفورمالديهايد.
يتم lysed الخلايا، والإفراج عن محتويات الخلية وchromatin هو مقص إلى أجزاء من أزواج قاعدة أقل من 1000، وعادة ما بين أزواج قاعدة 200 و 600. الحمض النووي، والتفاعل مع البروتين الهدف، هو مناعي باستخدام الأجسام المضادة وعزلها عن طريق فك crosslinking. يتم عكس الحمض النووي البروتين عبر وهضم الحمض النووي والبروتين.
يتم تنقية الحمض النووي، وجعلها في المكتبات، وتسلسل. يمكن أيضاً استخدام بيانات ChIP-seq للعثور على الربط التفاضلي لعوامل النسخ في الظروف البيئية المختلفة أو أنواع الخلايا. في البداية، تم تنفيذ ChIP من خلال التهجين على microarray.
ومع ذلك، أصبح تسلسل ChIP الطريقة المفضلة بسبب التقدم التكنولوجي، وتقليل الحواجز المالية أمام التسلسل، وحصيلة البيانات عالية الجودة الضخمة. في هذا البروتوكول، سوف نظهر تقنيات أداء ChIP-eq مع الأغشية الحيوية البكتيرية، وهي مصدر رئيسي للعدوى المستمرة والمزمنة. سيتم تنفيذ ChIP-seq على السالمونيلا التيثيموريوم بيو فيلم والخلايا العوالق، واستهداف منظم بيو فيلم الرئيسي، CSGD، لتحديد الربط التفاضلي في نوعي الخلية.
في هذا الفيديو، سوف نبرهن على تقنيات تحديد الكمية المناسبة من بيو فيلم للحصاد، وتطبيع عينة مراقبة العوالق، وتجانس بيو فيلم للوصول عبر الربط، وتنفيذ الخطوات الروتينية ChIP-seq للحصول على نتائج تسلسل عالية الجودة. خط السلمونيلا لوحة enterica تخدم typhimurium لدينا على لوحة LB أجار لعزل المستعمرات واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تلقيح خمسة مرق LB مل مع واحد إلى ثلاثة مستعمرات من لوحة متتالية واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة سبع ساعات أو لتسجيل النمو.
العثور على الكثافة البصرية لثقافة قارورة في 600 نانومتر، وذلك باستخدام مقياس الطيفية وإضافة واحد OD 600 ما يعادل من ثقافة الخلية أو 10 إلى الخلايا التسع إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على 100 ملليلتر من واحد في المئة tryptone. احتضان في 28 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة 13 ساعة. تظهر خلايا بيو فيلم كرقائق مجمعة وخلايا العوالق المفردة في الوسائط الملبدة بالغيوم.
بيو فيلم هي مقاومة عالية والتمسك الجانبين من الأنابيب ونصائح ماصة. نستخدم وسائل الإعلام مكيفة لنقل بيو فيلم في البداية واستخدام برنامج تلفزيوني دافئ على الفور قبل crosslinking لإزالة ركائز ربط البروتين في وسائل الإعلام. قد يحتاج الباحثون إلى إيجاد حل مناسب لإعادة تعليق بيو فيلم في.
جمع ثقافة قارورة في أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 12، 000 G لمدة 10 دقائق في 10 درجة مئوية. decant عظمى في وحدة مرشح 0.2 ميكرومتر وتصفية فراغ. Aliquot زراعة قارورة في أنابيب وطاردة مركزية بسرعة بطيئة لفصل نوعي الخلية.
خلايا بيو فيلم في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب والخلايا المفردة في عظمى غائم. الماصات التي تحتوي على الخلايا العوالق في أنبوب الطرد المركزي في وقت لاحق. ويوصى 25 ميكروغرام من الحمض النووي كمدخلات لتجارب ChIP-seq.
في حالتنا، 30 ملليغرام من بيو فيلم تسفر عن ما يقرب من 25 ميكروغرام من الحمض النووي. وبما أن مجاميع الأغشية الحيوية تحتوي على وفرة من المواد البروتينية خارج الخلية، فإنها تتنافس على الارتصال المتبادل وقد تؤدي إلى منتج غير متساوٍ متقاطع الربط معروض للمناعة. ويقترح إجراء تحليل البروتين لتحديد ما يعادلها من المواد الخلية من قبل البروتين تركيز.
في هذه الحالة، يتم حصاد ست خلايا OD 600 planktonic كتحكم في 30 ملليغرام من بيو فيلم. يتم حصاد بيو فيلم عن طريق الوزن الرطب ويمكن العثور على وحدات زراعة المستعمرة من بيو فيلم باستخدام عامل التحويل المبين. يتم تشجيع الباحثين على العثور على عامل التحويل من الأنواع التي تشكل بيو فيلم أنها تعمل مع التجانس وانخفاض التخفيف.
إعادة تعليق بيليه بيو فيلم في ملليلتر واحد من tryptone مشروط والانتقال إلى قبل وزنها اثنين من المليلتر سقف المفاجئة أو أنبوب قبعة المسمار. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة في 11،000 G.إزالة افرنح من الأنبوب ووزنها أنبوب بدقة. طرح الوزن أنبوب من وزن الأنبوب مع بيو فيلم للعثور على وزن المجاميع.
وينبغي أن يكون ضمن 10 ٪ من الوزن البيولوجي الهدف. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ودوامة لإعادة تعليق المجاميع بيو فيلم. الاستغناء عن ابر من سرعة بطيئة الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي.
قياس الكثافة البصرية للخلايا العوالق في 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيفية وحساب الحجم المطلوب لOD النهائي 600 من ستة. تبريد فلورا الطرد المركزي إلى 10 درجة مئوية بيليه الخلايا planktonic باستخدام فلورا الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي في 10،000 G لمدة 10 دقائق في 10 درجة مئوية.
إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني. Remeasure OD 600 من الخلايا planktonic باستخدام مقياس الطيف والاستغناء عن حجم ستة OD 600 الخلايا العوالق في اثنين ملليلتر المفاجئة أو المسمار سقف أنبوب. يجب أن تكون مجاميع بيو فيلم تفككت للسماح crosslinker للوصول إلى الخلايا.
يتم التعامل مع الخلايا العوالق بنفس الطريقة التي تعامل بها خلايا البيوفيلم لتقليل المتغيرات. قد يكون استخدام الخرز المعدني في مطحنة خلاط أكثر فعالية لكسر بيو فيلم من تجانس الأنسجة الزجاجية. Aseptically ، إضافة واحدة معقمة حبة معدنية لكل من الأنابيب.
التجانس باستخدام مطحنة خلاط لمدة خمس دقائق في 30 هيرتز. مراقبة الأنابيب المجمعة للتأكد من أن بيو فيلم قد تم تقسيمها بعيدا قبل نقل الخلايا المتجانسة إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر، وتجنب حبة معدنية. جلب وحدة التخزين إلى ملليلتر واحد مع برنامج تلفزيوني.
في هذه المرحلة، من الاختياري تنفيذ تخفيفات إسقاط تعداد خلايا الإدخال. الاستغناء الفورمالديهايد الطازجة في أنابيب عينة إلى تركيز نهائي من واحد في المئة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة.
إضافة الجليسين إلى تركيز نهائي من 125 ملليمولار لإخماد عبر ربط واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة. لغسل الخلايا وإزالة اللينكتر الزائد، الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 8،000 G وإزالة فائقة. إعادة تعليق بيليه في مثبطات protease و 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني معقم مرشح.
إعادة تعليق بيليه في 600 ميكرولتردات من العازلة تحلل واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. نقل lysate الجزئية إلى أنبوب جديد يحتوي على 1.4 ملليلتر من IP تخفيف العازلة. الحفاظ على الجليد لمدة ساعة ونصف إلى ساعتين ودوامة في بعض الأحيان.
قد تبقى بعض المواد المقاومة في الأنابيب. ومع ذلك، فإن فترة حضانة طويلة ودوامة عرضية تفكك المواد المجمعة وسيتم كسر ما تبقى خلال سونيكيشن. لحن sonicator.
ضع أنبوب 15 ملليلتر في منبر من الثلج ووضع المسبار داخل الأنبوب. نبض في 20 إلى 40 في المئة لخمس رشقات نارية سونيكيشن من 30 ثانية وبارد بين جولات sonication. الخلية lysate سوف تظهر غائم قبل sonication وسوف تظهر واضحة بعد sonication.
لإزالة المواد المترسبة، الطرد المركزي في 8،000 G لمدة 10 دقائق في أربع درجات والاستغناء عن المابير في أنبوب جديد، وتجنب بيليه السوداء. قد تختلف نقل الطاقة سونيكاتور ومقاومة نوع الخلية لذلك ينصح مقايسة صوتنة للعثور على عدد من الطلقات الصوتية التي ستنتج مجموعة حجم جزء المطلوبة لإعداد مكتبة المصب وتسلسل. توزيع الحمض النووي سونيكاتيد في واحد 1.35 ملليلتر aliquot للمناعة وواحد 200 ميكرولتر aliquot كما دخل الحمض النووي.
حافظ على التحكم في الإدخال عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى يتم إلغاء الربط المتقاطع وتهضم الخطوات. بعد اختبار الأجسام المضادة لضمان خصوصيتها للبروتين المستهدف ، أضف الجسم المضاد إلى أنابيب المناعة واحتضان عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على عجلة دوارة. إضافة 50 ميكرولترات من البروتين G الخرز المغناطيسي واحتضان في أربع درجات مئوية على عجلة دوارة لمدة ثلاث ساعات.
ربط الخرز إلى جانبي الأنابيب باستخدام موقف مغناطيسي وأداء يغسل. غسل مرتين مع 750 ميكرولترات من الباردة IP غسل العازلة واحد. غسل واحد مع 750 ميكرولترات من غسل IP الباردة العازلة اثنين.
وغسل مرتين مع 750 ميكرولترات من TE الباردة في الثامنة من النزل. إبقاء الأنابيب على موقف مغناطيسي أثناء يغسل. أضف 450 ميكرولترات من عازلة IP elution إلى كل أنبوب واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوامة لطيف كل خمس دقائق.
ربط الخرز إلى جانبي الأنابيب باستخدام موقف مغناطيسي. انتظر دقيقتين على الأقل حتى يصبح الحل واضحًا ثم قم بالاستغناء عن الحل المُطَلَّح إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. لعكس الروابط المتقاطعة وهضم الحمض النووي الريبي، أضف ميكروغرامين من RNase ثمانية وأضف كلوريد الصوديوم إلى تركيزك النهائي من 0.3 عث في كل أنبوب.
احتضان في 65 درجة مئوية لأكثر من ست ساعات أو بين عشية وضحاها. وهضم البروتين، أضف 180 ميكروغرام من البروتينات K إلى كل أنبوب واحتضان في 45 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس ساعات. تنقية الحمض النووي.
ويفضل الخرز المغناطيسي لعزل كميات صغيرة من الحمض النووي تعافى خلال ChIP مع الخلايا البكتيرية. ومع ذلك، قد استخراج العمود على أساس أو فينيل كلوروفورم استرداد الحمض النووي ChIP بشكل كاف. بعد تنقية، يتم إعداد المكتبات من الحمض النووي ChIP المنقى باستخدام مجموعة متوافقة مع منصة التسلسل المحددة.
تتطلب مكتبات الحمض النووي لـ ChIP في كثير من الأحيان إضافة الحد الأدنى من المحولات وتنفيذ الحد الأقصى لعدد دورات تضخيم PCR. تحقق من حجم المكتبة بواسطة محلل حيوي وتحقق من تركيز المكتبة باستخدام مجموعة أو مجموعة كمية لمكتبة QPCR. تجمّع المكتبات ثم تابع التسلسل وفقاً لمواصفات النظام الأساسي المحدد.
يتطلب تحليل بيانات ChIP-seq تسجيل جودة القاعدة ، وتقليم القواعد منخفضة الجودة ، ومواءمة الجمعية يقرأ إلى الجينوم المرجعي ، ويدعو القمم ، وربط القمم مع الجينات ، وتحليل الزخارف الملزمة الممثلة تمثيلا مفرطا. يحتوي عادةً على مستوى منخفض من الخلفية بيانات ChIP-seq. سيتم إثراء الحمض النووي الذي يتم التحكم فيه من قبل البروتين المستهدف بالمناعة وسيظهر كذروات تزيد على ضعفين على الأقل فوق الخلفية.
في هذا الفيديو ، وصفنا طرقًا لتنفيذ ChIP-seq على السالمونيلا بيو فيلم والخلايا العوالق الوحيدة التي تنتج قمم الحمض النووي المخصب في الجينات التي يسيطر عليها عامل النسخ من الفائدة. ويعتقد أن غالبية الحياة البكتيرية في الطبيعة موجودة في الأغشية الحيوية، ويعتقد أن ما يصل إلى 40٪ من الأمراض البشرية ذات الصلة بيو فيلم. لذلك لها آثار طبية واقتصادية هائلة.
ومع ذلك، بيو فيلم هو مقاومة وأكثر صعوبة في تعداد، وكسر مفتوحة، والتلاعب. يمكن للباحثين استخدام تقنيات ChIP-seq التي وصفناها لحصاد كمية مناسبة من البيوفيلم، وتجانس البيوفيلم، وخلايا التحلل، و sonicate، وأداء المناعة، وتنقية وتسلسل الحمض النووي من الأنواع البكتيرية الأخرى التي تشكل بيو فيلم.
