نحن ممتنون ل P. كيس و T. شميدت-ول للمساعدة التقنية الممتازة. وقد حظي هذا العمل بدعم من منحة البحوث التعاونية TRR81 وبرنامج هيزنبرغ (بو 1639 / 5-1) التابع لمؤسسة البحوث الألمانية، وجمعية ماكس بلانك، و إكسك 294 في فرايبورغ، ومجموعة التميز لنظام القلب الرئوي (إكبس) في جيسن إلى مرض السل

ملاحظة: يتم سرد كافة المخازن المؤقتة والمتوسطة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1 . اليومان 1 و 2 1. يشابك الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس خلايا T من لوحة 6 جيدا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 271 س ز. ريسوسبيند خلية بيليه في 30 مل من إدمم خلية ثقافة المتوسطة وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قسامة من 20 × 10 6 خلايا في أنابيب 50 مل جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الفورمالديهايد (فما) إلى تركيز النهائي 1٪ مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. تنبيه: فما سامة إذا استنشقت، لذلك العمل تحت غطاء الدخان وارتداء المعدات الواقية المناسبة. أيضا، يرجى التعامل مع النفايات فم وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1/8 الحجم من 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 7.0، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 271 زغ وغسل مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنابيب 1.5 مل. </li></ol> 2. خلية تحلل والكروماتين القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند الخلية بيليه في 1 مل من سدز تحلل العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب سونيكاتيون وأداء القص باستخدام أولتراسونيكاتور تركز وفقا للإعدادات المشار إليها في الجدول 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القص، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و ~ 18000 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى أنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 50 ميكرولتر لتحديد كفاءة القص وفقا للخطوة 3 والمفاجئة تجميد المحللة في النيتروجين السائل. تخزين المحللة في أليكوتس ذات الاستخدام الواحد في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحديد كفاءة القص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من العازلة شطف إلى 50 و #181؛ L من كل المحللة المقطعة واحتضان عند 65 درجة مئوية خلال الليل، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تي و 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) لكل عينة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب هلام مناسبة لاستخراج الكحول الفينول / الكلوروفورم / الإيزوميل. مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16000 زغ ونقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، و أسوميل الكحول أس النفاياتوفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك أنبوب مفتوح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنبوب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 ° C و ~ 17،900 x ز. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحمض النووي المنقى على فلوروميتر باستخدام مجموعة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل ما يقرب من 500 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز 1.8٪ وحوالي 1 نانوغرام على نظام الكهربائي باستخدام مجموعة عالية الحساسية. ملاحظة: سيز المتوقعه من شظايا الحمض النووي ما بين 200 و 500 نقطة أساس. </li></ol> اليومان 3 و 4 4. مناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 1 حجم من المحللة قص مع 5 مجلدات من المخزن المؤقت التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بريكليري مع 30 ميكرولتر / مل البروتين وحبات الاغاروز (أعدت وفقا للتذييل ألف ) لمدة 30 دقيقة في حين الدورية في الغرفة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في ~ 750 x ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10٪ من المدخلات وتخزينه في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة المبلغ المطلوب من المحللة في أنابيب جديدة (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل). إضافة الأجسام المضادة المطلوبة لكل أنبوب (انظر الجدول 3 لمزيد من التفاصيل) وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من البروتين وحبات واحتضان لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في حين الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخرز مع 1 مل من العازلة منخفضة الملح، العازلة عالية الملح، العازلة ليكل، والعازلة تي (لكل غسل، واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في حين الدورية وأجهزة الطرد المركزيلمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ). انظر الجدول 3 للحصول على التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 110 ميكرولتر من العازلة شطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، فورتيكسينغ كل 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و ~ 950 زغ ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى أنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 4.7-4.8 مع 100 ميكرولتر من العازلة شطف والجمع بين إيليتس. إضافة شطف عازلة تصل إلى 200 ميكرولتر لإدخال العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li></ol> يوم 5 5. دنا تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تي إلى كل شطافة و 8 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز (0.2 ميكروجرام / ميكرولتر التركيز النهائي). مزيج واحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين K (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي) إلى كل شطافة واحتضان لمدة 2 ساعة عند 55 درجة مئوية، مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى هلامأنبوب مناسب ل فينول / كلوروفورم / إيسواميل كحول إستخراج؛ مقبض وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) ويهز الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 24 درجة مئوية و ~ 16،000 x ز. نقل المرحلة العليا إلى أنابيب جديدة. تنبيه: الفينول، الكلوروفورم، والكحول الإيزواميلي هي سامة إذا استنشاق وتآكل. والعمل تحت غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. أيضا، التعامل مع الفينول، الكلوروفورم، ونفايات الكحول الإيزواميلي وفقا لقواعد المؤسسة المضيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكرار مرة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي باستخدام أعمدة تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع التعديلات التالية: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغشاء مرتين. بعد غسل الماضي، وترك الأنابيب مفتوحة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتبخير الايثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شطف، إضافة 50 ميكرولتر من H 2 O، احتضان في تمبراتو الغرفةإعادة لمدة 1 دقيقة، وتدور الأنابيب لمدة 1 ثانية ل رطب بشكل صحيح الغشاء، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة قبل التنازل عن الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 24 درجة مئوية و ~ 17،900 x ز. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

تشيب هو تقنية صالحة للتحقيق في ما إذا كانت البروتينات أو بتمس لها إثراء في مناطق الجينومية محددة. نتائج فحص رقاقة غالبا ما تكون صعبة للتفسير لأسباب بيولوجية أو فنية. الأسباب البيولوجية كثيرة و تشمل ضعف أو غير مباشر ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي. وهناك أيضا قيود تقنية، مثل خصوصية الأجسام المضادة محدودة وتحلل الخلايا غير فعالة أو القص الكروماتين. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ( الجدول 5 ) يمكن أن تساعد القارئ على حل المشاكل التي قد تواجهها مع المقايسات رقاقة. هذا البروتوكول، والاستفادة من جهاز أولتراسونيكاتور تركز التبريد، يسمح واحد لكفاءة القص لونين من ناضجة الماوس T- خط الخلية. وتتمثل الخطوة الحاسمة الرئيسية للبروتوكول من قبل القص من لونين، والتي يجب دائما أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. ويقترح لتغيير عدد الخلايا وعدد دورات سونيكيشن. وعلاوة على ذلك، وقالت انها<html> أرينغ الكفاءة يتأثر سلبا وجود سدز يترسب في العينات، والتي قد تشكل خلال تحلل الخلايا على الجليد مع سدز تحلل العازلة. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاحتضان العينة بعد تحلل في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق للحد من وجود رواسب سدز. فمن المستحسن لتحسين البروتوكول للحصول على شظايا مقطوعة بين 200 و 500 نقطة في البوصة وتقييم دائما جودة القص من العينات قبل الشروع في مناعي. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الأمثل الوقت التثبيت، وكمية من الأجسام المضادة و / أو الخلايا، وظروف الغسيل الأمثل لكل الأجسام المضادة. خطوة واحدة أكثر أهمية في اتخاذ إجراء رقاقة ناجحة هو اختيار الأجسام المضادة، والأجسام المضادة منخفضة النوعية تقلل بشكل كبير من كفاءة إمونوبريسيانتاتيون. سابقا، يسمح إجراء اختبار الجودة موحدة لتقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة في السوق<html> سس = &quot;كريف&quot;&gt; 19. واستند خط أنابيب الفرز على لطخة نقطة، وصمة عار الغربية، و تشيب، وتوفير قائمة من الكواشف عالية الجودة مناسبة ل تشيب 19 . في الآونة الأخيرة، تم تقييم خصوصية العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا باستخدام عالية الكثافة هيستون الببتيد ميكروأري منصات، مما يسمح لإنشاء قاعدة بيانات حول خصوصية الأجسام المضادة 20 . يمكن للقارئ استخدام هذه الأداة المفيدة لتحديد الأجسام المضادة الأكثر تحديدا التي يمكن استخدامها لتجارب رقاقة. لم يتم اختبار هذا البروتوكول لخلايا T الأولية، وفي هذه الحالة، يجب على القارئ الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة الأخرى التي تؤدي بنجاح رقاقة على خلايا T الأولية 3 ، 4 ، 21 . ومن الجدير بالذكر، وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لأداء رقاقة على السلف الفأر خط T- الخلية، وكذلك على خط الخلايا البطانية الماوس. ove_content &quot;&gt; 5 × 10 6 خلايا ينبغي أن تستخدم لكل مناعي لتحليل علامات هيستون لأن هذا البروتوكول يمكن أيضا أن تكون مناسبة، مع بعض التحسين، لأداء رقاقة على تفس أو العوامل المساعدة، فمن الأفضل لزيادة عدد الخلايا المستخدمة في إمونوبريسيانتاتيون في هذه الحالات.من أجل الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل تجربة، يمكن تجميع أكثر أليكوتس من المحللة المقطوعة معا قبل تمييع لونين في المخزن المؤقت التخفيف. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لأداء رقاقة على البروتينات الذاتية التي لا ترتبط مباشرة إلى الحمض النووي. في هذه الحالة، قد يكون مطلوبا تثبيت مسبق مع بروسلينكرز البروتين البروتين (على سبيل المثال، ديميثيل أديبيميديت، دما) (انظر الملحق ب لمزيد من المعلومات). كان أداء ناجح من رقاقة على العوامل المساعدة سابقا من خلال أوفيركسريسينغ البروتينات التي تنصهر إلى علامة البيوتين. في هذه الحالة، تم تنقية البروتين مع ستريبتافيدين-كونجوغاتيد الخرز المغناطيسي، و قبل تثبيت مع دما تم تنفيذ 22 .

تعتمد التنمية والتمايز والتوازن على برامج التعبير الجيني محددة التي يتم إنشاؤها من خلال إشارات الأحداث التي تعدل بنية الكروماتين، وبالتالي تحديد ما إذا كان يتم تنشيط جين معين أو قمعها بطريقة الخلية والوقت المحدد. خلال تطوير الخلايا التائية، يجب إنشاء برامج التعبير الجيني محددة لتحديد نضوج السلائف خلية T من السلبي المزدوج (دن) إلى حالة إيجابية واحدة (سب)، يمر عبر عدة مراحل وسيطة 1 . كيف تم تنظيم برنامج التعبير الجيني ديناميكيا خلال تطوير الخلايا التائية تم التحقيق على نطاق واسع في السنوات السابقة من قبل العديد من المختبرات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . عن طريق التعديلات بعد متعدية (بتمس) من الهيستونات، وتبادلهيستونيس الكنسي مع المتغيرات هيستون، الطرد نوكلأوسوم، ومثيلة الحمض النووي تنظم التبديل أون / أوف من الجينات. وقد حققت عدة مجموعات في توزيع الجينوم على نطاق واسع من بتمس والمتغيرات هيستون لتحديد العلامات التي ترتبط مع مختلف دول الكروماتين في كل من المناطق التنظيمية القريبة والبعيدة 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تشوير الشلالات تنظيم تنظيم كروماتين الديناميكي عن طريق تبادل الإيجابية والسلبية إنزيمات تعديل الكروماتين (المعروف أيضا باسم معدلات الكروماتين) في عناصر محسن محددة. هذه المعدلات لونين تنظيم هيكل الكروماتين، وبالتالي الناتج النسخي من قبل، على سبيل المثال، مثيلة هيستون الديناميكي والأستيلاتيون. هذا هو الحال في مسار إشارات الشق 11 ، 12 ، 13 ،14 - ديناميكية هيستون بتمس. التبادلات مع المتغيرات هيستون. وإمكانية الإشغال الديناميكي للهيستونات، عوامل النسخ، والعوامل المساعدة يمكن التحقيق من قبل المقايسات المناعية (رقاقة) لونين. وتستخدم الأجسام المضادة محددة للغاية لتنقية المجمعات الحمض النووي البروتين محددة، ويتم تحليل الحمض النووي المنقى عن طريق ير الكمية (قر). تسلسل عميق (تشيب-سيق)؛ أو أقل تواترا في الوقت الحاضر، التهجين ل ميكروأري (رقاقة رقاقة). مقايسات رقاقة في بعض الأحيان تحديا بسبب المضاعفات مع تحلل الخلايا، القص من لونين، و / أو خصوصية منخفضة من الأجسام المضادة. وقد اعتمدت عدة استراتيجيات لتحسين البروتوكول، كما هو الحال بالنسبة إلى نيكسون 15 . استخدام التبريد سونيكاتورس حمام المياه يتجنب عينة التدفئة التي قد تلحق الضرر الحواتم الموجودة على البروتين قيد التحقيق، ولكن الطاقة المطلوبة لقص العينات يحصل فرقت في الماء.تم إجراء تحسين آخر مع تطوير أجهزة أولتراسونيكاتيون تركز التي تمنع تشتت الطاقة. ولذلك، تركز أجهزة أولتراسونيكاتور تسمح للتحسينات في تحلل الخلايا والكروماتين القص، والقضاء على الاختلافات التي يسببها المشغل وزيادة كبيرة في استنساخه. يصف هذا العمل بروتوكول (نظرة عامة التخطيطي في الشكل 1 ) لأداء بكفاءة رقاقة من البروتينات هيستون في خط ناضج الفأر T- دعا E2-10HA 16 ، 17 . الخلايا التائية عادة ما تكون صعبة ل ليس، وقد تم الكشف عن القص من الكروماتين لتكون غير فعالة. في هذا البروتوكول، مما يجعل من استخدام أولتراسونيكاتور تركز على التبريد، تم تحسين عدد الخلايا، العازلة تحلل، ووضع القص ل E2-10HA الماوس خط الخلايا T. يسمح هذا البروتوكول واحد لأداء رقاقة مع استنساخ عالية وفي وقت معقول. في الواقع، فإنه ريكيرإس ما يقرب من يومين لقص الكروماتين وتقييم نوعية القص، وثلاثة أيام لأداء المناعي، عكس الارتباط، وتنقية الحمض النووي.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

وتقوم مسارات التشوير بتنظيم برامج التعبير الجيني من خلال تشكيل بنية الكروماتين على مستويات مختلفة، مثل التعديلات بعد متعدية (تي تي أم) لتيول هيستون، وتبادل الهيستونات المتعارف عليها مع المتغيرات هيستون، وإخلاء النيوكليوسومات. يتطلب هذا التنظيم ملزمة لعوامل النسخ الحساسة للاشارات (تفس) التي تجنيد الانزيمات تعديل الكروماتين في العناصر التنظيمية التي تعرف بأنها المعززات. فهم كيفية تنظيم شلالات تنظيم نشاط محسن يتطلب تحليل شامل لربط تفس، الكروماتين تعديل الإنزيمات، وإشغال علامات هيستون محددة والمتغيرات هيستون. المقايسات المناعية (رقاقة) الكروماتين استخدام أجسام مضادة محددة للغاية ل إيمونوبريسيبيتات بروتين معين / المجمعات دنا. تحليل لاحق من الحمض النووي المنقى يسمح لتحديد المنطقة المحتلة من قبل البروتين المعترف بها من قبل الأجسام المضادة. يصف هذا العمل بروتوكول ل بي كفاءةتشوه، بسبب، هيستون، بروتينز، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، إنضج، الفأر، T-سيل، سطر. بروتوكول عرض يسمح لأداء المقايسات رقاقة في إطار زمني معقول ومع استنساخ عالية.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.3K Views.  University of Giessen.  يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Biochemistry

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للنسيج الدهني البنى موريني

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

رسم خرائط عالية الدقة للتفاعلات البروتينية-الحمض النووي في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس باستخدام Chromatin immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...