طريقتنا هامة لأنها تسمح للباحثين بعزل ومعالجة أنواع الخلايا المختلفة للتحقيق في مساهماتهم الفردية في شكل الأنسجة ووظيفتها. هذه التقنية هي طريقة لطيفة وفعالة لفصل أنواع الخلايا ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على سلامة الخلايا لثقافة 3D. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى لعزل الخلايا التي ليس لديها علامات حيوية جيدة.
لحصاد عدد اثنين وثلاثة وأربعة وخمس غدد مامارية من فأر أنثى يبلغ من العمر 10 إلى 14 أسبوعًا ، قم أولاً بعمل شق سنتيمتر واحد عند خط الوسط بين الغدد الخلفية. مدّ القطع إلى الرقبة وإجراء قطع جانبية صغيرة من شق خط الوسط نحو الأطراف. ثم تمتد الجلد تدرس قبل تأمينه مع دبوس على كل جانب من الحيوان.
باستخدام ملقط، وجمع العقد الليمفاوية من عدد الغدد الأربعة. لإزالة الغدد الثديية، واستخدام مقص حاد لقطع تحت كل منطقة من الأنسجة، ووضع الأنسجة في 50 ملليلتر من أربع درجات مئوية DMEM-F12 تكملها 5٪ FBS والمضادات الحيوية المضادة للالميكوtic كما يتم حصادها. عندما تم جمع جميع الأنسجة، فرم الغدد حتى يمكن أن تناسب القطع بسهولة من خلال طرف ماصة ملليلتر واحد تدوير لوحة حسب الضرورة بحيث يتم مفرومة جميع الأنسجة بالتساوي.
ثم نقل الشظايا في ثلاثة ملليلتر من وسط الهضم إلى بئر واحد من طبق التصاق منخفض من ستة بئر لمدة 14 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي، الماصات بلطف الأنسجة 10 مرات مع ميكروبيبت ملليلتر واحد ونقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من DPBS الطازجة.
تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية النايلون قبل الرطب 70 ميكرومتر، شطف الأنبوب في المصفاة أربع مرات مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM-F12 لكل غسل. لإطلاق شظايا الأنسجة، عقد علامة التبويب مصفاة مع أصابع قفاز وعكس مصفاة على طبق ثقافة الأنسجة 60 ملليمتر. تمرير أربعة ملليلتر واحد aliquots من وسط الصيانة من خلال الجزء السفلي من المصفاة وتفحص بسرعة الطبق للخلايا الفردية، قطرات الدهون، وتلويث الأنسجة تحت مجهر مقلوب.
ثم ضع الطبق في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة للسماح لشظايا الأنسجة بالتمسك بالطبق وتوليد شظايا ثنائية الطبقات. لفصل الخلايا الظهارية من الخلايا الظهارية الإنارة، شطف الطبق مع ملليلتر واحد من DPBS قبل إضافة ملليلتر واحد من 0.5٪ 10٪التربسين-EDTA إلى الخلايا. مراقبة الهضم بعناية تحت المجهر المقلوب.
سوف تبدأ الطبقة الخارجية من الخلايا الميوفية في الانفصال في غضون ثلاث إلى ست دقائق. عندما تكون خلايا ثنائية في اخلايا منفصلة، نقل عظمى إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على مليلترين من 10٪ FBS في DPBS. دون إزعاج الخلايا الظهارية اللمعانية ، شطف الطبق بلطف مع ملليلترين من DPBS قبل إضافة ملليلتر جديد من التربسين -EDTA إلى الخلايا المتبقية.
بعد سبع إلى 15 دقيقة، يطفئ التفاعل الأنزيمي مع ملليلترين من 10٪ FBS في PBS ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. من المهم مراقبة الخلايا عن كثب أثناء التبسينية التفاضلية وعدم هضم الخلايا. عندما تم جمع كل من الكسور، الطرد المركزي الخلايا لإزالة أي مبيد تفكك المتبقية و ريسيد الكريات في 250 ميكرولترات من الصيانة المتوسطة لكل أنبوب.
بعد العد، وتمييع كل مجموعة خلايا إلى 1.2 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل تركيز جيد في وسط الصيانة الطازجة. إضافة 90 ميكرولترات من 50٪ مصفوفة خارج الخلية في DMEM-F12 دون الفينول الأحمر إلى كل بئر من شريحة غرفة ثمانية جيدا. عندما تكون جميع الآبار مغلفة، ترسيخ الطبقة الأساسية في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.
خلال هذا البلمرة، وجمع كسور الخلية عن طريق الطرد المركزي و resuspend كل مجموعة في 100 ميكرولترات من 10٪ مصفوفة خارج الخلية في 90٪ متوسطة النمو في البئر. بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من كل تعليق الخلية إلى كل بئر والسماح للثقافات المشتركة لتسوية لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، بعناية إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة النمو أسفل الجانب من كل جدار الغرفة والعودة إلى الشريحة الحاضنة ثقافة الخلية.
صورة الخلايا كل 24 ساعة لتتبع نموها وتجديد بلطف متوسطة النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام. لإصلاح organoids للمناعة، في الوقت المناسب التجريبية، pirate بعناية المتوسطة من كل شريحة ليتم تصويرها وشطف كل جيدا مع 200 ميكرولترات من DPBS في البئر. إصلاح organoids مع 200 ميكرولترات من أربع درجات مئوية paraformaldehyde لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل علاج organoids مع 200 ميكرولترات من 0.2 ٪ في DPBS في البئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، permeabilizes organoids مع 0.25٪ triton X-100 في DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها عرقلة الربط غير محدد مع مصل 5٪ حمار أو المصل المناسب الذي يطابق أنواع الأجسام المضادة الثانوية في DPBS لمدة ساعة واحدة مع هزاز. ثم تسمية الخلايا مع 125 إلى 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة في مصل 1٪ حمار في DPBS بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز. في صباح اليوم التالي، غسل كل جيدا مرتين مع 200 ميكرولترات من DPBS بالإضافة إلى تريتون X-100 قبل وضع علامة على organoids مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة مزدوجة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز محمية من الضوء.
ثم غسل كل جيدا مرتين مع DPBS الطازجة بالإضافة إلى تريتون X-100 كما أظهرت وصورة organoids بواسطة المجهر الفلوريسنس وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد 24 ساعة من الحضانة ، التزمت الشظايا الظهارية المنقية بالجزء السفلي من طبق الثقافة لتشكيل هياكل مسطحة تشبه الفطائر مع طبقة خارجية من الخلايا المنوية التي تحيط بطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الإنارةية. علاج التربسين يفصل بشكل تفاضلي الخلايا مع الخلايا ميوفي فيليليال فصل الأولى والظهير كخلايا مستديرة مشرق التي تطوق جوهر الخلايا الظهارية اللمعانية الكُبُل المتبقية.
النقاء العام للحجرتين الخلية حوالي 90٪ كما تم تقييمها من قبل تعبير الكيراتين-14 و E-cadherin داخل المجموعتين السكانيتين. بعد 10 أيام من الثقافة في 10٪ مصفوفة خارج الخلية على 50٪ قاعدة مصفوفة خارج الخلية كما هو موضح، شكلت خصية الخلايا الظهارية ميوفية ظهارية كبيرة هياكل متفرعة مع التجويف متطورة. التمايز في اليوم الخامس مع إضافة إلى alveologenesis المتوسطة يحفز تشكيل أكبر, أكثر تشعبا تحتوي على الحليب organoids.
من المهم أن نتذكر لغسل المصفاة بعناية عند جمع الظهارة لضمان عدم وجود ملوثات السترومال. للاستعلام عن التغيرات في التعبير الجيني، يمكن للباحثين جمع الحمض النووي الريبي من الغدد التناسلية عن طريق إطلاقها من المصفوفة خارج الخلية باستخدام محلول استرداد. ويعتبر Paraformaldehyde الخطرة وينبغي على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية والعمل داخل غطاء الدخان عند استخدام هذا الكاشف.
