هذا مورين خارج القناة الصفراوية القناة الجهازية النظام يمكن معالجة الوصول المحدود إلى نماذج قبل الظهر cholangiopathies والقيود المفروضة على الخلايا الجذعية متعددة القدرات والكبد المستمدة من نماذج الجهازية cholangiocyte. نموذجنا هو البالغين الأنسجة محددة، الاختزال، استنساخ، والوقت وفعالة من حيث التكلفة. وسيكون له فائدة خاصة للمختبرات التي لا يمكن الوصول إلى الأنسجة البشرية.
يسمح أسلوبنا زراعة عدد غير محدود تقريبا من cholangiocycytes القناة الصفراوية خارج القناة لدراسة تجديد الأنسجة والتفاعلات من خلية إلى خلية. إثبات الإجراء سيكون جونيا شيوتا، طبيبة ما بعد الدكتوراه من مختبري. بالنسبة لعزل القناة الصفراوية داخل الجسم، ضع الفأر البالغ في موضع الضم وفتح تجويف البطن على طول خط الوسط.
سحب الكبد للراحة على الحجاب الحاجز واستخدام الهيموستات لسحب بلطف الاثني عشر القريبة للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة مباشرة تحت هيلوم الكبد. استخدم مشرط لفصل القناة الصفراوية خارج الجسم عن الأنسجة المحيطة. عقد الطرف القريب من القناة الصفراوية المشتركة مع ملقط، تشريح القناة distally فقط فوق منعطفها مع الاثني عشر قبل تشريح الطرف القريب من القناة من الكبد.
ضع القناة الصفراوية الخارجية المعزولة على الفور في لوحة زجاجية تحتوي على عازلة الغسيل البارد على الجليد ، ثم قم بتنظيف القناة الصفراوية من الأنسجة المحيطة وينخرم في أقسام 0.5 ملليمتر. عندما تم مفرم جميع الأنسجة، ونقل المقاطع إلى أنبوب يحتوي على 500 ميكرولترات من العازلة للتفكك لمدة 20 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الانفصام، تحييد العازلة مع 500 ميكرولترات من الجليد الباردة ثقافة الخلايا المتوسطة triturate تعليق الأنسجة 20 مرة من خلال إبرة 18 قياس ومن ثم 20 مرة من خلال إبرة 20 قياس.
ثم قم بتصفية تعليق الخلية الناتجة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. لإقامة ثقافة الجهاز الصفراوية، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإزالة بعناية ناطور. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من الجليد الباردة، برنامج تلفزيوني عقيم ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي الثاني.
Resuspend بيليه غسلها في 120 microliters من السيل، والجليد الباردة مصفوفة الطابق السفلي ولوحة 40 ميكرولترات من الخلايا في وسط كل من ثلاثة آبار من 37 درجة مئوية الدافئة، 24 جيدا لوحة، ثم وضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عندما مصفوفة الطابق السفلي قد توطدت، إضافة 600 ميكرولترات من 37 درجة مئوية البذور المتوسطة لكل بئر قبل إعادة لوحة إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام وكل ثلاثة أيام بعد ذلك، استبدال المتوسطة البذر مع 600 ميكرولترات من وسط الثقافة العضوية الطازجة، ورصد النمو العضوي بانتظام مع المجهر المقلوب.
لتمرير الثقافات القناة الصفراوية خارج الكبد، ماصة organoids في كل بئر مع 400 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني 10 مرات في البئر قبل نقل محتويات البئر إلى أنابيب 1.5 ملليلتر الفردية. مرور كل خليط من خلال إبرة 25 قياس أربع مرات لتفكك organoids وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق الخلايا في مصفوفة الطابق السفلي في نسبة مناسبة لإعادة الطلاء.
لتخزين القناة الصفراوية خارج المدى، يغسل كل بئر من organoids مع PBS درجة حرارة الغرفة دون إزعاج قطرات مصفوفة الطابق السفلي وإضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة تجميد المتوسطة لكل بئر. إعادة بناء الأعضاء بلطف ونقل الخليط إلى قوارير مبردة فردية، ثم ضع القنينات في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل نقل الأعضاء إلى خزان النيتروجين لتخزين على المدى الطويل في مرحلة بخار. لإعداد organoids embedding البارافين، استبدال المتوسطة مع 500 ميكرولتردات من أربع درجات مئوية PBS ونقل التعليق من كل بئر إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر تحتوي على مصفوفة الطابق السفلي المسال.
جمع organoids عن طريق الطرد المركزي واستخدام تلميح P1000 ماصة معدلة لإزالة بعناية عظمى دون إزعاج الكريات. ثم إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة، 4٪ شبه شكلي إلى organoids لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، استبدل التثبيت بميليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة PBS لاحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل الأعضاء عن طريق الطرد المركزي ثلاث مرات.
بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق organoids في ملليلتر واحد من 30٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق حضانة في درجة حرارة الغرفة، تليها حضانة لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. في نهاية 70٪ من حضانة الإيثانول، وجمع organoids عن طريق الطرد المركزي و resuspend organoids في ملليلتر واحد من 100٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية 100٪ من حضانة الإيثانول، وحرارة عينة معالجة هلام في الميكروويف لمدة 20 ثانية أو حتى السيل، وإضافة 50 ميكرولترات من هلام السيل إلى كل أنبوب من organoids.
ضع الأنابيب على الجليد حتى يتم ترسيخ هلام معالجة العينة ونقل قطرة organoids من كل أنبوب إلى ما بين منصات الإسفنج الزرقاء في كاسيت لمزيد من المعالجة في تضمين البارافين. ضع الكاسيت في معالج الأنسجة المبرمج لمدة 15 دقيقة لكل خطوة ، ثم قسم العضوية المضمروسة في هلام معالجة العينات في أربعة ميكرومتر لكل قسم من أجل التلطيخ الكيميائي المناعي والتحليل وفقًا للبروتوكولات القياسية. خارج الكبدية القناة الصفراوية كفاءة الطلاء الجهازي هو ما يقرب من 2٪عندما معزولة عن الفئران إما حديثي الولادة أو الكبار.
بعد مرور اثنين، وكفاءة الطلاء من organoids القناة الصفراوية خارج الجسم المشتقة من الفئران الكبار يزيد إلى 11٪، وتبقى مستقرة. غالبية organoids تظهر مورفولوجيا الكيسية في جميع أنحاء جميع الممرات مع organoids نادرة غير منتظمة. وتصل العضيات إلى ذروة النمو في خمسة إلى سبعة أيام، وبعد ذلك تبدأ في تراكم الحطام داخل الالوان وتتدهور.
لذلك ، للحفاظ على الثقافة العضوية ، يجب تقسيم الأعضاء كل سبعة إلى 10 أيام. عندما يتم تحليلها مع الفلوروس المناعي ، تتكون العضوية الصفراوية خارج القناة من مجموعة نقية من الخلايا الظهارية التي تتميز بـ E-cadherin. تظهر الخلايا العضوية أيضًا علامات خلايا السلف الصفراوية وكذلك علامات التمايز الصفراوي.
الأهم من ذلك، نسبة عالية من الخلايا العضوية تمتلك سيليوم الأولية التي تميزت أسيتيلات ألفا Tubulin، وهو سمة من سمات cholangiocytes العادية ويقترح الاستقطاب الخلايا العضوية المناسبة. مطلوب الالتزام الوثيق بحالة درجة الحرارة الموصوفة. تشريح القناة الصفراوية الدقيقة يمنع تلوث خلايا البنكرياس.
يمكن تجنب فقدان المواد الخلوية عن طريق التلاعب الدقيق بعد الطرد المركزي. ويمكن استخدام هذه العضيات كنماذج قبل الفحص، يتم التلاعب بها وراثياً ودوائياً، أو استخدامها لاختبار المخدرات وآثار العوامل المعدية. يمكن استخدام هذه الطريقة من قبل المختبرات التي ترغب في الاستفادة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لمواصلة دراسة آليات بيولوجيا cholangiocyte.
