يلاحظ بروتوكولنا أن استخدام مستخلصات الكلى من الأبقار والخنازير هو مورد ممتاز واقتصادي لدراسة علم وظائف الأعضاء الكلوي ، ولا سيما دراسة العلاقة بين عامل النمو البطانية الوعائية وغيرها من التحليلات. لقد كان دائما تحديا لربط VEGF، وهو عامل نمو أساسي في تكوين الأوعية الجهاز، مع البروتينات الأخرى. هذه التقنية تسمح لنا بفحص العلاقة بين VEGF وanalytes مثل الهرمونات.
وهذا بالتأكيد سوف يعزز قاعدة معرفتنا فيما يتعلق بعامل النمو الهام هذا. قد تكون هذه الطريقة مفيدة لربط التحليلات الأخرى في مستخلصات الكلى القشرية إلى جانب تلك المذكورة في هذا الفيديو. سوف تساعد العرض التوضيحي المرئي الآخرين للحصول على نتائج قابلة للتكرار دون أي أخطاء في أخذ العينات.
استخدام الأنسجة الطازجة أمر ضروري لنجاح هذه التقنية. من المهم الحصول على الكلى الكاملة الطازجة مباشرة بعد ذبح من. دائماً ما تنقل الأنسجة إلى المختبر على الجليد.
استخدام مقص معقمة، ملقط، سكين، وأطباق بيتري لتشريح الكلى واستئصال الجزء المطلوب من الأنسجة. قطع بلطف الكلى إلى نصفين على طول الطائرة القوس وقطع قطعة من الأنسجة من منطقة القشرة في وسط الكلى. رمز الأنسجة إلى قطع صغيرة مع السكين ونقلها إلى أنبوب microfuge مع ملليلتر واحد من الجليد البارد 1X RIPA تحلل استخراج العازلة.
تسمية أنبوب مع تفاصيل عينة محددة ووضعها على الجليد. استخدم التجانس المحمولة مع مسبار معقمة لتجانس الأنسجة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى لا تكون قطع مرئية، ثم فورا الطرد المركزي الأنبوب في 9، 600 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، إعداد aliquots منفصلة من العينة ل ELISA وتحليل البروتين الكلي لتجنب دورات تجميد/ذوبان متعددة.
قبل البدء في الفحص، وجلب جميع الكواشف وطبقة الفحص إلى درجة حرارة الغرفة إزالة الآبار الزائدة وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام. تمييع العازلة غسل 20X إلى 300 ملليلتر مع الماء المقطر مزدوجة واقامة الآبار الفارغة دون أي حل. إضافة 50 ميكرولترات من معيار أو عينة وآخر 50 ميكرولترات من الفجل peroxidase conjugate إلى كل بئر، ثم تضاف على الفور 50 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة لكل بئر وختم لوحة.
اخلطي الطبق و احتضنيها بـ 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وغسل كل جيدا مع 200 ميكرولترات من العازلة الغسيل. إضافة 50 microliters من الركيزة A والركيزة باء إلى كل بئر، وخلط لوحة بلطف عن طريق التنصت على الجانب، ثم ختم واحتضان ذلك في الظلام لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
إضافة 50 ميكروليتر من وقف حل لكل بئر. اضغط بلطف على اللوحة وقراءة امتصاص في 450 نانومتر مع مقياس الطيف. إعداد الكواشف وغسل العازلة كما وصف سابقا، ثم إضافة 100 ميكرولترات من معيار أو عينة إلى كل بئر، وختم لوحة، اخلط جيدا، واحتضانه لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.
إزالة السائل في كل بئر وإضافة 100 ميكرولترات من كاشف الكشف A.ختم لوحة واحتضانه لمدة ساعة أخرى. بعد ذلك ، اغسل كل بئر مع 400 ميكرولترات من عازلة الغسيل ، ثم أضف 90 ميكرولترات من محلول الركيزة لكل بئر ، اضغط بلطف على اللوحة ، واحتضانها لمدة ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة الماضي، إضافة 50 ميكرولترات من وقف الحل لكل بئر، والاستفادة بلطف لوحة، وقراءة امتصاص في 450 نانومتر مع مقياس الطيف.
تقدير البروتين الكلي من استخراج الكلى البقري والبورسين مع معيار BSA فحص واستخدام هذا التقدير لتطبيع LH و VEGF-A-ELISA النتائج. تم حساب متوسط ومتوسط مستويات LH و VEGF لكل من الحيوانات والجنسين. وبعد التحقق من حالة البيانات الطبيعية، استخدمت نماذج الانحدار الخطي لدراسة العلاقة بين LH و VEGF.
تم العثور على LH لتكون مؤشرا قويا وكبيرا من VEGF في كل من الأبقار والكليات porcine. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن العينة مناطق متطابقة في كل نسيج. ويمكن استخدام إجراء مماثل لاستخراج أي نوع من الأنسجة.
تذكر أن تطبيع التحليلات عن طريق استخراج البروتين الكلي من أي أنسجة تستخدمها.
