بروتوكولنا مهم لأنه يسمح للباحثين بالتحقيق في الآلية الجزيئية لتنشأة الأوعية التاجية خارج الكائن الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها النماذج بدقة عملية تولد الأوعية التاجية داخل كائن حي ، مما يسهل دراسة آليات تولد الأوعية التاجية. تبدأ برش فأرة حامل تحمل يوم الجنين 11.5 الأجنة مع 70٪ الإيثانول.
رفع الجلد على البطن مع ملقط، واستخدام مقص لجعل الجلد البطني شق الصفاقي في شقاً شقاً شخصياً ولاحقاً حتى الحجاب الحاجز لفضح قرن الرحم. الامساك بالرحم، قطع الأنسجة الحرة وسحب قرن الرحم. ضع سلسلة الأجنة في نظام PBS المعقم البارد تحت مجهر ستيريو، وقش عضلات الرحم، كيس الصفار، وغطاء الأمنيون من كل جنين.
كما يتم عزل كل جنين، واستخدام ملعقة مثقبة لنقل الأنسجة إلى طبق بيتري جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني عقيم على الجليد. لحصاد أنسجة القلب الجنينية، نقل أول جنين يتم تشريحه في طبق بيتري جديد تحت المجهر، ووضع الجنين في الجانب البطني. استخدم ملقطًا ناعمًا لإجراء شق صغير في الصدر، فوق الحجاب الحاجز قليلاً، وأدخل ملقطًا مغلقًا في الشق لتكبير الشق.
باستخدام ملقط لعقد جدار الصدر مفتوحة لفضح القلب والرئتين، واستخدام زوج الثاني من ملقط لتحريك بلطف القلب 90 درجة في وقت ما للكشف عن الشريان الأبهر الظهري والوريد. ثم، واستيعاب هذه الأوعية في قاعدة القلب، وسحب بعناية القلب والرئتين في وقت ما قبل وشطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني الباردة. عندما يتم حصاد جميع أنسجة القلب، ضع عينات القلب تحت المجهر وأزل فصوص الرئة من كل قلب.
توجيه القلب الأول على جانبها الظهري، وعقد القلب في قاعدتها، واستخدام ملقط غرامة لكشط الأذين الأيسر والأيمين في الأنسجة المجاورة المحيطة SV من القلب. لعزل SV، توجيه الجانب الظهري القلب. إزالة بعناية SV من القلب واستخدام ماصة نقل معقمة لوضع الأنسجة المعزولة في طبق بيتري ستة سنتيمترات جديدة تحتوي على الجليد الباردة معقم برنامج تلفزيوني على الجليد.
لعزل البطينينين كله، وإزالة المسالك الخارج واستخدام ماصة نقل معقمة جديدة لوضع البطينين في طبق بيتري ستة سنتيمترات منفصلة تحتوي على الجليد الباردة معقم برنامج تلفزيوني على الجليد. لإعداد SV وثقافات البطينين بأكملها ، اغطي أولاً أغشية ثمانية ميكرومتر مسام PET تضاف في بئر من 24 لوحة ثقافة جيدة ، مع 100 ميكرولترات من المصفوفة الخارجية الخلايا المخففة حديثًا لكل ثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. عندما توطدت المصفوفة، استخدم ماصة نقل لنقل explant واحد على كل إدراج، ونقل لوحة تحت المجهر.
باستخدام ملقط نظيفة، وضع explants في مركز كل إدراج لضمان أنها ليست تعلق على الجدران الجانبية، وإزالة بعناية أي برنامج تلفزيوني إضافي. المقبل، نقل لوحة مع غطاء مغلقة تحت غطاء ثقافة تدفق لارينار، وإضافة 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل قبل الدافئة لكل إدراج، و 200 ميكرولترات إلى أسفل كل إدراج. ثم إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى أي آبار غير المستخدمة، ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمسة أيام.
ل VEGF -A العلاج في اليوم الثاني من الثقافة ، وإزالة المتوسطة من كل غرفة من كل ثقافة وإضافة 100 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني لكل إدراج ، و 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. بعد دوامة لوحة عدة مرات، استبدال برنامج تلفزيوني مع 300 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية تكملها مصل الأبقار الجنينية 1٪ لبدء الثقافات، والعودة إلى لوحة الحاضنة. في اليوم الثالث بعد المجاعة، إضافة 300 ميكرولترات من المتوسطة القاعدية الطازجة بالإضافة إلى المصل إلى آبار التحكم والمتوسطة القاعدية بالإضافة إلى 50 نانوغرام لكل ملليلتر من VEGF-A إلى آبار العلاج، وإعادة اللوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية.
في اليوم السادس من الثقافة، وغسل الغرف مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإصلاح الثقافات مع 200 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde في كل بئر، و 100 ميكرولترات من المثبت في كل إدراج. بعد 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مع هزاز، وغسل الثقافات مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل غسل مع هزاز في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير، إضافة 300 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى الآبار وإدراج لثقافة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز.
في صباح اليوم التالي ، وغسل الثقافات 10 مرات في السطح غير الأيونية في برنامج تلفزيوني مع هزاز ، وتغيير محلول الغسيل كل 10 دقائق قبل وضع العلامات على الثقافات مع 300 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة fluorophore مترافق في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع هزاز. في اليوم التالي ، وغسل الثقافات 10 مرات في برنامج تلفزيوني جديد مع السطح غير الأيونية كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير، استخدم ملقط غرامة لتقشير الغشاء بعناية من كل إدراج ووضع الأغشية على شرائح المجهر الزجاج الفردية، explant الجانب.
تغطية العينات مع DAPI تكمل تصاعد المتوسطة في زلة الغطاء، وختم حواف زلات الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة. عندما جفف طلاء الأظافر، صورة الشرائح عن طريق المجهر confocal. كما تنمو خلايا SV الأولية على بطين القلب، أنها تتوقف عن إنتاج علامات الوريدية مثل انقلاب TF2.
بعد خمسة أيام من الثقافة، تنبت الخلايا البطانية SV وتهاجر على الغشاء. كما هو الحال في القلب الجنيني، يتم تقليل التعبير Coup-TF2 مع هجرة الأوعية بعيدًا عن SV. الثقافات حفزت مع معرض VEGF-A زيادة نمو براعم أوعية على حد سواء في الكثافة والطول. مزيد من الثقافات SV حفز من قبل VEGF-A تثبت زيادة ثلاثة أضعاف تقريبا في طول براعم بالمقارنة مع الضوابط, مما يشير إلى أن براعم البطانية من SV وsocardium تستجيب ل VEGF-A.
من المهم عدم فقدان الأنسجة SV أثناء سحب القلب والرئتين، وإزالة الأذين، وتنظيف الأنسجة المجاورة المحيطة SV. يمكن إجراء تجارب التصوير الحية لتصور تولد الأوعية التاجية والتقاط تفاصيل الديناميات الخلوية والجزيئية أثناء العملية. هذه التقنية مفيدة للغاية لتقييم الآليات الجزيئية المحتملة لنشأة الأوعية التاجية وكنظام نموذجي لدراسة تولد الأوعية بشكل عام.
