نشكر كريستين جونسون لعمل الرسوم البيانية.

وتعرض جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات إلى وأقرته اللجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مستشفى بوسطن للأطفال وتتم وفقا لتوصيات الاتحاد للتقويم والاعتماد من رعاية الحيوان المعملية (AAALAC). تأكد من استخدام أدوات معقمة وtechniqure العقيم أثناء تنفيذ الإجراء. 1. إعداد الكريات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 10 ملغ من sucralfate و 60 ملغ من hydron مع ملعقة unbent معقمة. وضع في أنابيب microcentrifuge منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة 1 سم مربع من شبكة إلى العقيمة 10 سم الطبق. عكس ذلك شبكة ترتكز على غطاء الضحلة. توضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول إلى hydron ودوامة لمدة 10 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية مناسبة من عامل النمو (القياسية: 20 ميكروغرام للbFGF، 50 ميكروغرام للVEGF) إلى sucralfate ودوامة لفترة وجيزة. عامل النمو تخزينها في-80 ° C الفريزر بتركيز 1 ملغ / مل. يجب أن حجم السائل أضاف أن ما لا يقل عن 20 ميكرولتر لضمان sucralfate هو مبلل تماما ولكن يجب أن لا تتجاوز 50 ميكرولتر. أكبر حجم يجعل تبخر السائل في الخطوة التالية صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الخليط sucralfate في المبخر الطرد المركزي تعيين على الأقل حتى يصبح الخليط الجاف تماما، وعادة 30-50 دقيقة اعتمادا على حجم السائل المستخدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الخليط لمدة الرطوبة المتبقية مع نهاية مدبب من ملعقة معقمة. الخليط يجب أن يشعر &quot;مقدد&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نهاية مدبب من ملعقة لتفريق خليط sucralfate داخل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من hydron إلى sucralfate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظرا لطبيعة لزجة من hydron، وقطع من نهاية الماصة غيض 200 ميكرولتر ومن ثم رسم والافراج عن 10 ميكرولتر قبل pipetting صعودا مرة أخرى وإضافة إلى sucralfate. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام بسرعة خلاف عازمةالعلا لخلط hydron وsucralfate وإزالتها من الأنبوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخليط على طول الجانب السفلي من غيض من ملعقة عازمة ثم تدوير أنبوب أثناء الرسم ملعقة على طول جدار الأنبوب. سوف الخليط يجف بسرعة لذلك يجب أن يتم ذلك خطوة بكفاءة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر الخليط على شبكة مستعدة باستخدام ملقط ليثبت في مكانه. يجب أن يكون الخليط حتى طبقة وملء في الثقوب للشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج ملعقة عازمة في أنبوب يحتوي على hydron واستخدامه معطف كلا الجانبين للشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شبكة المغلفة متوكئا على الجانب ضد حافة الطبق والسماح للتجفيف في RT لمدة 30-45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شبكة في الثلاجة -20 درجة مئوية أو الشروع فورا في الخطوة التالية. إبقاء شبكة داخل الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 35 مم طبق داخل طبق بتري أكبر، الغطاء. استخدام زوج من ملقط لسحب بعناية الألياف للشبكة بغض النظر على مدى 35 مم طبق. الكريات الضالة جويتم جمعها من الطبق أكبر في نهاية المطاف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الكريات عن التوحيد تحت النطاق. عملية ينتج حوالي 250 الكريات بالتالي الجرعة القياسية في بيليه لbFGF وVEGF هو 80 نانوغرام و 200 نانوغرام، على التوالي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الكريات في 35 مم طبق في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. </li></ol> 2. زرع الجراحي من الكريات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء منطقة الجراحية تحت المجهر التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع AVERTIN (400-500 مغ / كغ، داخل الصفاق) ووضع مؤشر الماوس تحت المجهر حتى العين مرئيا. أداء قرصة أخمص قدميه لضمان مستوى كاف من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير العين الماوس عن طريق وضع 1 قطرة من حل بروباراكايين فوق مقلة العين. انتظر 20-30 ثانية وربت مع الشاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proptose العين الفأر مع # 1 مبلد المجوهرات ملقط يجري المؤكد أن ترك الجلد بين ملقط والعين. من المهم أن نحكم على الضغوط التي مورست بشكل صحيح.60. وعقد العين بقوة أيضا يؤدي إلى أن تصبح حمراء وغضب، بينما تفقد أيضا على عقد سيسمح للتحرك العين أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام microknife 30 درجة إلى إجراء شق في القرنية حوالي 1 ملم من حوف. يجب أن يكون الشق 1-2 ملم في الطول. يجب أن تكون شق عميق بما يكفي لاختراق ما وراء الطبقة الظهارية في midstroma لكن ليس عميق جدا للتمزق العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام سكين فون Graef لجعل جيب عمودي على شق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرك السكين تحت طبقة القرنية في موقع شق والعمل بلطف سكين في وتحريكه على طول شق لتوسيع الفضاء، وبالتالي تشكيل الجيب. فإنه يساعد على تحريك الماوس وكذلك لتكون قادرة على العمل مع انحناء العين. يجب الحرص على عدم دفع نحو الانخفاض مع طرف لتجنب تمزق العين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب ملقط صائغ رقم ​​5 مع بروباراكايين واختيار بيليه للخروج من الطبق. وضع بيليه على العين. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب سكين فون Graef مع بروباراكايين ونقل بعض من السائل على بيليه لجعله مطاطي ولين العريكة. إزالة الرطوبة الزائدة مع الشاش أو القطن المسحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بيليه في الجيب باستخدام سكين فون Graef لدفعها داخل تحت طبقة القرنية. مرة واحدة بيليه كله في الداخل، تشغيل الجانب المسطح من سكين فون Graef على الموقع للتأكد من أن بيليه هو آمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف العين مع مرهم مضاد حيوي الثلاثي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الماوس مرارا وتكرار لعملية جراحية في العين المعاكس. </li></ol> 3. الكمي من القرنية اتساع الأوعية الدموية. ترك الحيوانات لتطوير السفن على مدى فترة محددة من الوقت. اليوم سفينة الدرجات يعتمد على عامل النمو المستخدمة. الصف bFGF في يوم 5 وVEGF الأضعف في يوم 6. يوم هو يوم غرس 0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع AVERTIN (400-500 مغ / كغ، داخل الصفاق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجهر المصباح الشقي لجرادينغ. بصري واحد لديه شبيكة الشعر، وخطوط داخل العدسة المستخدمة كوسيلة مساعدة لتحديد قياس طول السفينة والمسافة حول محيط العين أن السفن قد ظهرت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الماوس أمام نطاقها، وتحديد المواقع الماوس بحيث ينظر إلى العين في العين مع بيليه مباشرة إلى الأمام. استقرار الرأس بين الإبهام والسبابة بحيث يتم تشديد الجلد على الوجه وproptosed العين قليلا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ذ محور للشبيكة الشعر على طول سفينة الحوفي مباشرة تحت بيليه. قياس طول الأوعية المتفرعة في اتجاه تصاعدي الكريات. يسجل هذا القياس في أعشار من ملليمتر وتعيين طول السفينة (VL) (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الماوس أو شبيكة الشعر بحيث تكون المسافة حول العين أن هذه السفن قد ظهرت تصبح واضحة. فمن الأسهل أن نفكر في العين والوجه على مدار الساعة مع فترات من 1 إلى 12. المعين هذه الساعة ساعة عدد (CH) (الشكل 1B). يمكن أن يكون رقما صحيحا أو كسور 0.25 (على سبيل المثال، 2، 2.25، 2.5 أو 2.75). ملاحظة: CH هو ذاتي. على سبيل المثال، البعض قد قياس المسافة حول العين لتشمل جميع السفن ظهرت من حوف حين أن البعض الآخر قد يتوقف قياس عند نقطة حيث طول السفينة هو نصف القصوى. العامل المهم هو أن تكون متسقة مع واحد كيف يختار الصف. </li></ol><img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> الرقم 1. الكمي لاتساع الأوعية الدموية القرنية. (A) 80 نانوغرام bFGF بيليه مزروع في C57BL / 6J الماوس يظهر المصباح الشقي شبيكة الشعر موجهة لقياس طول السفينة. VL = 0.9 مم. (B) نفس الاداء العين المصباح الشقي شبيكة الشعر استدارة لقياس ساعة على مدار الساعة. CH = 3.25. حساب مساحة سفينة = 1.84 مم 2. هذه الصور تم تعزيز رقميا للسماح لإضافة التخطيطي شبيكة الشعر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مساحة سفينة (VA) باستخدام الصيغة أدناه، والتي تقوم على مساحة بيضاوي (ملاحظة، فإنه من المفيد أن تضع ذلك في الاعتبار عند الدرجات.) اكسبريس VA في ملليمتر مربع. الصيغة هي كما يلي: سفينة طول × مدار الساعة ساعة X 0.2 = π منطقة السفينة </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li><li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+angiogenesis+in+vitro:+light+microscopic,+ultrastructural,+and+radioautographic+studies.">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li><li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+models+of+vascular+functions.">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li><li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit's+ear.">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li><li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+angiogenesis+assays:+progress+and+problems.">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li><li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay.">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li><li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization.">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+growth+and+neovascularization:+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea.">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li><li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice.">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li><li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هناك العديد من الخطوات الهامة في إجراء فحص القرنية ناجحة. أول من صنع كريات موحدة قادرة على أن تزرع وتحفيز الأوعية. أهم أجزاء من إعداد بيليه هي 1) باستخدام عامل النمو خالية من الناقل. 2) ضمان وجود مزيج جيد من عامل النمو مع sucralfate وhydron و3) تحريك الخليط النهائي بسرعة ولكن بعن?...

عملية تكوين الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة تشكل تلك الموجودة مسبقا، معقد للغاية وينظم من قبل العديد من العوامل الداخلية التي تتحكم في الخطوات المختلفة لتنتشر السفن والتشكل. يتم تشغيل الأوعية الدموية بسبب حدوث تحول في التوازن بين العوامل المؤيدة والمضادة للعائية، وهو التوازن الذي يحافظ عادة على الأوعية الدموية في حالة سكون. الأوعية الدموية في البالغين يحدث في بعض الظروف الفسيولوجية مثل أثناء دورة المبيض الأنثوية أو في عمليات إصلاح مثل التئام الجروح وتجديد الأنسجة. ومع ذلك، فإنه هو أيضا السمة المميزة للعديد من الأمراض بما في ذلك الأورام الخبيثة، وظروف المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية. اشتراك الأوعية الدموية في هذه الظروف الفسيولوجية والمرضية يجعل من موضوع هام للبحث وهدفا جذابا للعلاج. نظرا لتعقيد الأوعية الدموية وإشراك العديد مLLS والعوامل في هذه العملية، بما في ذلك الخلايا البطانية، pericytes، تعميم خلايا والخلايا اللحمية، في المختبر تظل نماذج محدودة ولا يمكن أن ألخص فريدة من نوعها المكروية في الجسم الحي. الرئيسية في فحوصات المختبر من الأوعية الدموية وتركز بشكل كبير على مراقبة الآثار المباشرة على الخلايا البطانية وقياس خطوات معينة في عملية عائية تحت ظروف خاضعة للرقابة. وتشمل هذه المقايسات الكمي من الخلايا البطانية انتشار 1، 2 الهجرة، وتشكيل شبكة 3، تشكيل أنبوب 4 و 5 تنبت من الكروية. خارج الحي النماذج، على عكس تلك الموجودة في المختبر، هي أكثر تعقيدا ودمج أنواع الخلايا الأنسجة المتعددة، على سبيل المثال الراهن حلقة الأبهر فحص 6. ومع ذلك، مثل أنظمة أخرى، فإنه لا يمكن التقاط مساهمة خلايا تعميم وسدى الطبيعي للخلايا البطانية كما موجود في الجسم الحي. محاولاتلدراسة الأوعية الدموية تحت تدفق لتقليد تتم باستخدام أنظمة ميكروفلويديك 7 الإعداد في الجسم الحي، ولكن حتى هذه المقايسات، وإن تحسنت كثيرا، لا تزال غير قادرة على حساب لجميع المقصورات الموجودة في الجسم الحي. بسبب القيود المفروضة على في المختبر، وبحكم نماذج الأوعية الدموية الجسم الحي، في الجسم الحي نماذج تبقى الخيارات أكثر موثوقية للدراسات الأوعية الدموية. أمثلة على هذه النماذج تشمل غرس غرف شفافة، &quot;ويندوز&quot;، التي تسمح التصور من تزايد الأوعية الدموية تحت المجهر 8، يزرع تحت الجلد عن طريق الحقن مثل تشكيل matrigel والسفينة في الأنسجة الطبيعية مثل الماوس الأذن وغشاء مشيمائي الدجاج (CAM ). ومع ذلك، واحد من النماذج الأكثر قبولا الأوعية الدموية والكمية في الجسم الحي هو فحص القرنية micropocket اتساع الأوعية الدموية وصفها هنا، التي تستغل بشكل طبيعي اوعائيالقرنية بمثابة &quot;شاشة&quot; لتصور وتقييم النمو عائية جديد 9. نحن هنا وصف micropocket فحص القرنية وتطويرها في الفئران. في البداية تم استخدام نموذج لقياس المحفزات عائية غير محددة في القرنيات أرنب. وقد تم ذلك عن طريق إدخال قطع الورم في الخلط المائي في الغرفة الأمامية للعين الأرنب ويقاس اتساع الأوعية الدموية التي يسببها الورم 11. ومع ذلك، فقد تطورت الفحص في وقت لاحق لدراسة آثار النمو محدد 10 العوامل لتحديد وتوحيد تأثير عائية أفضل. من أجل الافراج عن عامل النمو في العين، استخدمت الكريات بطء الإفراج تحتوي على كميات معروفة من عوامل النمو عائية بدلا من الأنسجة. توفر تنقية البروتينات المؤتلف عائية مثل bFGF أو VEGF تمكين استخدامها كأهداف محددة من modulaters الأوعية الدموية 12. في البداية، كان الفحصتستخدم إلى حد كبير في الأرانب، والتي هي أسهل للعمل مع نظرا لحجمها ولكن في وقت لاحق وقد ترجم هذا النموذج في الفئران. نموذج حيواني أصغر حجما وأقل تكلفة. التحول من أرنب على الفئران تقدم ميزة هامة لتكون قادرة على استخدام الحيوانات التلاعب وراثيا، مما يخلق مجالا جديدا للبحث في المكونات الوراثية التي تؤثر على الأوعية الدموية 13. بالإضافة إلى استخدام أكثر قبولا من القرنية الفحص في دراسة الأوعية الدموية، ويمكن أيضا عمليات بيولوجية أخرى يجري التحقيق باستخدام فحوصات تعديل. على سبيل المثال، قدمت دراسات lymphangiogenesis ممكن من خلال غرس انخفاض الكريات جرعة bFGF الذي يسمح التصور من الأوعية اللمفاوية من خلال الواسمات الجزيئية محددة 14. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت هذا الاختبار وسيلة لتقييم آثار الإشعاع على الأوعية الدموية 15. في الجمع، والقرنية micropocket فحص الأوعية الدموية هو كمي، مندوبroducible، وتقييم مرونة الأوعية الدموية في الجسم الحي. والميزة الرئيسية لهذا الاختبار هي أن قياس السفن الخلفية غير ضروري لأن الأوعية تنمو في الأنسجة اوعائي بشكل طبيعي. نحن هنا وصف بروتوكول من هذا الاختبار في التفاصيل ومناقشة السيناريوهات المختلفة التي يمكن أن تحدث. يتكون الاختبار من 3 قطاعات منفصلة. هنا فإننا سوف تصف إعداد عامل نمو شامل الكريات، وغرس الجراحية لاحقا، وأخيرا الطريقة المستخدمة لقياس النمو التوعية المستحدثة الناتجة عن ذلك.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

الماوس القرنية micropocket الفحص هو فحص قوي والكمي في الجسم الحي لتقييم الأوعية الدموية. باستخدام الكريات بطء الإفراج موحدة تحتوي على عوامل النمو المحددة التي تؤدي إلى نمو الأوعية الدموية في جميع أنحاء القرنية اوعائي بشكل طبيعي، الأوعية الدموية يمكن قياسها كميا و. في هذا الاختبار يتم إنشاء استجابة عائية على مدار عدة أيام، وهذا يتوقف على نوع وجرعة من عامل النمو المستخدمة. يتم تشغيل تحريض اتساع الأوعية الدموية عادة إما عاملا أساسيا نمو الخلايا الليفية (bFGF) أو عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). من خلال الجمع بين هذه العوامل النمو مع sucralfate وhydron (بولي HEMA (بولي (ميتاكريليت 2 هيدروكسي))) وصب الخليط في الكريات، ويمكن زرعها جراحيا في العين الماوس. هذه الكريات موحدة ببطء الافراج عن عوامل النمو أكثر من خمسة أو ستة أيام (bFGF أو VEGF على التوالي) مما يتيح استجابة عائية الكافية اللازمة لف منطقة السفينةuantification باستخدام المصباح الشقي. هذا الاختبار يمكن استخدامها لمختلف التطبيقات، بما في ذلك تقييم المخدرات المغير عائية أو العلاجات وكذلك المقارنة بين خلفيات وراثية مختلفة تؤثر على الأوعية الدموية. محقق المهرة بعد ممارسة هذا الاختبار يمكن زرع بيليه في أقل من 5 دقائق لكل عين.

وتظهر نتائج نموذجية لbFGF وVEGF في الكريات العادية منخفضة عائية C57BL / 6J الفئران في الشكل 2A و B على التوالي. يبين الشكل 2E التوزيع الطبيعي من منطقة السفينة (VA) في C57BL / سلالة 6J بجرعات متفاوتة من هذه نمو العوامل. 80 الكريات bFGF نانوغرام يؤدي عادة في VA حوا...

Watch this Scientific Journal Video about The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye at JoVE.com

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

يصف بروتوكول الفحص micropocket القرنية كما وضعت في الفئران.

والقرنية Micropocket الفحص: نموذج من الأوعية الدموية في العين ماوس

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Views.  Boston Children's Hospital.  يصف بروتوكول الفحص micropocket القرنية كما وضعت في الفئران. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

وسحق العصب البصري النموذجي إصابة الفئران لدراسة الخلايا الشبكية بقاء العقدة

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

الكشف عن لوحات لالتهاب الأعصاب في مرض ألزهايمر النموذجي ماوس

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

والفحص السلوكية بسيطة لاختبار وظيفة البصرية في<em&gt; القيطم المورق</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

أسلوب حجمي للتحديد الكمي للمخ بالتشنج في نموذج موريني نزيف تحت العنكبوتية

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...